分子生物学研究方法《分子生物学》幻灯片.ppt

第五章 分子生物学研究方法; 分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。;基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程. 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。 本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等三个环节。 ;三大成就 ：;1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验;2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；;Description of the 3-D structure of DNA;Conservative Model;3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。;但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。 ;两大技术保证：;;重组DNA实验中常见的主要工具酶;1972 - Paul Berg,; 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。 ;分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。;从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。;1973 - Boyer, Cohen Chang;;;General process of gene engineering;5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。;5.2 DNA操作技术?;5.2.1.1 基本原理; 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。;琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶类型及浓度 ;在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。;称样;取样;结果;5.2.2 核酸的分子杂交; 不同温度下DNA的构型变化一; 不同温度下DNA的构型变化二; 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。;杂交模式图;Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测; 在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术，虽然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。;2.Northern blotting（诺赛恩RNA印迹技术） 是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 ;3.Western blotting（韦斯顿蛋白质杂交技术） 将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。;检测重组体克隆的菌落杂交技术;In situ hybridization;1.将快速生