分子生物学技术新进展课件.pptVIP

分子生物学技术新进展; 二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面，分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。;分子生物技术概述 分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 ;重组DNA技术的发展史;是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合的DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆。 (常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等)。; 1、分离纯化目的基因 　2、目的基因 + vector =重组DNA分子 　3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 　4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 　5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。 ; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。 将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。;重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源）;;聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）;5?;二、PCR技术的主要用途;（四）DNA序列测定 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； （五）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 ;三、几种重要的PCR衍生技术;原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测，可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。; 目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检查等。;（三）实时定量PCR (real-time PCR)技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ;分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique;复性;目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断， 恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检 测等领域中，其成果大大促进了现代医学 的进步和发展 。;印迹技术（ Blotting Technique ）原理 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹， 因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 ;（一）DNA印迹 (Southern Blotting);其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip);生物芯片技术 Biological Chip Technique;蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作