鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性分析-微生物学专业论文.docxVIP

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特 性研究 摘 要 鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）与胰蛋白酶的底物特异性类似，但其热 稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶，可作为胰蛋白酶替代品。另外，在鱼糜加工过程中，MBSP 降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因之一。因此，对鱼类 MBSP 的重组表达 及其酶学特性研究，可为开发 MBSP 作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶及研制鱼类 MBSP 抑 制剂提供理论依据。 本文以淡水鲫鱼为研究对象，以鲫鱼肌肉中总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 技术获得了 鲫鱼 MBSP 基因（MBSP）片段，其开放阅读框为 729bp，编码 242 个氨基酸残基，在其 N-末端存在一个含 20 个氨基酸残基的信号肽。因此，成熟鲫鱼 MBSP 基因（MBSP2）大 小为 669 bp，编码 222 个氨基酸残基。通过基因重组技术将成熟鲫鱼 MBSP 基因片段 （ MBSP2 ） 整 合 到 毕 赤 酵 母 的 染 色 体 上 ， 成 功 构 建 了 重 组 酵 母 表 达 菌 株 GS115/ pPIC9K-MBSP2。将该菌株在摇瓶中用 1.0 %甲醇进行诱导表达，在发酵液上清中可检测到 分子量约 36 kDa 的重组蛋白。Western blotting 鉴定该重组蛋白为重组鲫鱼 MBSP。同时， PAS 染色证明了该重组鲫鱼 MBSP 为糖蛋白。 在 7 L 发酵罐中对重组酵母表达菌株 GS115/ pPIC9k-MBSP2 进行高密度发酵，获得其 适宜的工艺条件为：发酵温度在 28.5-29.5℃之间、pH 范围在 5.2-5.8 之间、溶氧量保持在 30%以上、流加方式为溶氧控制、间断补加甲醇诱导 32 h。发酵结束时，发酵液 OD600 可 达 56.2，菌体湿重为 123.9 g/L。 通过对不同分离纯化技术进行合理组合及其工艺条件的 优化，建立了一套重组鲫鱼 MBSP 的分离纯化工艺流程：7 L 发酵罐中发酵→ 离心取发酵 液上清→ 30-60%硫酸铵沉淀→透析→Q-Sepharose 阴离子交换层析→超滤脱盐及浓缩→冷 冻干燥。最终获得了重组鲫鱼 MBSP 的固体产品，可用于酶学性质分析及其应用研究。 重组鲫鱼 MBSP 的酶学性质研究包括底物特异性、最适温度和温度稳定性、最适 pH 和酸碱稳定性、酶抑制剂和金属离子对其酶活的影响。底物特异性研究表明，重组鲫鱼 MBSP 可水解蛋白质中赖氨酸的羧基端肽键，而不识别精氨酸残基，这与蛋白质质谱鉴定 中的工具酶 Lys-C 的水解特性相类似；其最适反应温度和 pH 分别为 55℃和 pH7.5；该酶 具有较好的热稳定性和酸碱稳定性；丝氨酸蛋白酶抑制剂及高浓度金属离子可显著抑制其 活性。此外，重组鲫鱼 MBSP 能快速降解鲫鱼肌原纤维蛋白，这与天然鲫鱼 MBSP 特性类 似。 将重组鲫鱼 MBSP 与蛋白质质谱鉴定中的工具酶 Lys-C 的酶学性质进行比较。结果表 明，重组鲫鱼 MBSP 具有热稳定性高、pH 适用范围宽、对底物的亲和力强及反应速度快 等优势。另外，重组鲫鱼 MBSP 能有效降解如牛血清白蛋白（BSA）和精氨酸激酶等典型 I II II 蛋白质。因此，重组鲫鱼 MBSP 有望作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶。 关键词 鲫鱼，肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶，毕赤酵母表达系统，酶学特性，新型蛋白 工具酶 III III Recombinant expression and characterization of myofibril-bound serine proteinase from crucian carp (Carassius auratus) Abstract The fish myofibril-bound serine proteinase (MBSP) is similar with trypsin in substrate specificity, and it is more outstanding in thermostability than mammalian trypsins. Thus, it can be used as a trypsin substitute. On the other hand, MBSP can degrade myofibrillar proteins efficiently which was proposed to be responsible for the modori phenomenon during surimi production. Therefore, it is necessary to express a recombinant MBS