常用分子生物学技术原理及应用课件.ppt

第二十一章;分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology;DNA变性的本质是双链间氢键的断裂;例：变性引起紫外吸收值的改变;热变性; Tm： (melting temperature); DNA的复性 ;（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。;DNA-DNA 杂交双链分子;复性;1. 原理 变性与复性 2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因 3. 分子杂交的目的;;核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 ;（二）探针技术;探针标记方法: 放射性： 32P、35S和3H 非放射性：生物素、地高辛素、 荧光素 (FITC、罗丹明);二、印迹技术（印迹杂交）;印迹技术的分类及应用; 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip); （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。;Southern印迹法;Southern和Western印迹法;分子杂交实验;（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) ;（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) ;实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS； 4 蛋白质的转移； 6 目的蛋白质的检测。;蛋白质免疫印迹法;免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 测定相对含量时，需要内参照 选择合适的反应条件：SDS胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择 注意电极的正负极 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 操作要轻柔。;三种印迹技术的比较;分子杂交实验;放射自显影照片;DNA点阵;1、印迹技术的分类;聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction;PCR概述; 1985年，美国PE Cetus公司的Kary Mullis建立了PCR技术，使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍，Kary Mullis因此获1993年度诺贝尔化学奖。;原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。;一、PCR反应体系;1、DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶： 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 作用： ①5’?3’DNA聚合酶活性； ②无3’?5’外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别； ;最适温度： 72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5～6min 延伸温度（72℃） ≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性;pfu DNA聚合酶; 2.引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100?l ◆设计原则： （1）靠近5‘上游Primer与双链DNA正链相同 （2）Primer 本身不要出现内部互补序列形成 loop环，内部二级结构 （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp （4）Primer 5’未