蝗绿僵菌CQMa102体表入侵相关基因MaChy的克隆和分析-生物学专业论文.docxVIP

摘要蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）是一类应用广泛的虫生真菌，在农业害虫生 物防治中起着重要作用。虫生真菌的致病力是影响其广泛使用的主要限制因素， 迄今为止，实验室在前期工作中构建了蝗绿僵菌 CQMa102 在侵染过程中，相比于 体内，在体表时期的高表达的差减文库，从此文库中，选择了蝗绿僵菌 CQMa102 体表时期高表达的一条 EST 序列，该 EST 序列长 750bp，经过比对发现该序列与 其他物种中的氰化物水合酶的同源性较高。 利用本实验室构建的 蝗 绿僵菌 CQMa102 在产孢时期的均一化全长 cDNA 文库，获取了该基因（MaChy）的 cDNA 全长。通过以基因组为模板 PCR 扩增后克隆测序的方式，成功获取了 MaChy 基因 的 DNA 全长。利用 RNAi 的方法研究了 MaChy 的功能。主要研究结果如下：① 获得了 MaChy 基因的 cDNA 全长，并进行了相关生物信息学分析。MaChy 基因 cDNA 序列全长为 1202bp，5’端有 80bp 的 UTR 区域，3’端有 50bpUTR 区 域，其开放阅读框为 1074bp。预测该基因编码 357 个氨基酸，与多个物种如 eptosphaeria maculans(AAF66098.1)、 Aspergillusniger(XP_001389844.1)、Fusarium solani (CAM82815.1)、Neurospora crassa(XP_960160.2)、Penicillium chrysogenum Wisconsin(XP_002562104.1) 、 Aspergillus niger(ABX75546.1) 、 Alternaria brassicicola(AAP88966.1) 对应所编码都有 97%以上的蛋白同源性。该蛋白没有信 号肽，也不具有跨膜的结构。② 生物信息学分析结果显示，该蛋白的分子量 39.78 kDa,等电点为 5.53。为 酸性蛋白。预测其在 177 位（NASK）、206 位（NASE）、332 位（NSTD）氨基 酸处存在 N-糖基化位点；4 位（TIR）、77 位（SMR）、300 位（TKK）、323 位（TPK）氨基酸处存在蛋白激酶 C 磷酸化位点； 104 位(SELD)、134 位（THVE）、 179 位（SKHE）、341（STLE）处有一个酪蛋白激酶 2 磷酸化位点；122 位（GTVINH）、144 位（GSGDSL）、238 位（GARLGL）、262 位（GNGYSR）N-十四酰化位点。③ 通过 PCR 扩增基因组送测序后，获取了 MaChy 基因的 DNA 全长，将 DNA 序列与 cDNA 序列用 DNAMAN 软件比对，结果显示：MaChy 基因不含内含子， DNA 全长 1202bp。④ 采用 RNAi 的方法进行 MaChy 基因的功能研究。构建 MaChy 基因的农杆 菌介导法转化的 RNA 干扰载体后，通过农杆菌介导的方法转化蝗绿僵菌 CQMa102 中，经过培养基的初筛和 PCR 筛选后，获得多个稳定的 MaChy 基因干扰突变株。⑤ 分析了 MaChy 基因干扰突变株的毒力变化，统计分析发现干扰突变株和 出发菌株的半数致死时间没有显著差异，推测 MaChy 基因的功能与毒力不相关。⑥ 观察干扰突变株与出发菌株在附着胞形成方面的差异，从多个角度进行统计分析，在附着胞形成比率，形成时间，附着胞形态，附着胞大小都没有显著的 差异。⑦ 分析了 MaChy 基因在体表和体内的表达差异。统计定量 PCR 数据得到的 结论显示，在体表阶段的表达量最高，大约是体内表达量的 2.5 倍，而在 1/4SDA 液 体培养基中的表达量与体内表达量基本相同，表明该基因在体表阶段是高表达的。关键词：绿僵菌，MaChy 基因，RNAi，干扰突变株ABSTRACTThe ascomycetes Metarhizium acridum was well characterized entomopathogenic fungi and widely used in biological control programs. The overall host range of M. acridum is broad. During the invasion steps , the formation of appressorium was very important.So cloning and identification of the Characteristics of appressorium formation related gene are necessar