细胞培养常见问题分析解决.PDF

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 细胞培养常见问题分析解决 摘要 ：细胞转染时 ，细胞状态的好坏对转染效率有很大影响。细胞污染可能会导致细胞死亡 ，本文主要总结了细胞 培养中常见污染现象和解决方法。 细胞污染 凡是对细胞生长有危害的成分或者造成细胞不纯的异物都视为污染。细胞污染根据污染源可以分为化学污染 ，物理 污染和生物污染。 化学污染 细胞培养所用到的培养基 ，水要高压蒸汽锅灭菌。其中 ，血清作为细胞培养中常用的培养基 ，血清存在潜在的化学 污染 ，此外血清成分具有不确定性 ，血清对不同细胞的生长影响包括毒副作用等存在差异。 物理污染 物理污染 ，主要指温度、振动、放射线、辐射等物理因素对细胞的破坏。如将细胞液培养基等暴露于放射线或紫外 线下 ，会引起细胞代谢改变。恒温培养箱的周围存在能够产生机械振动的设备 ，可能也会对细胞生长存在一定影响。 微生物污染 1.细菌 ：细菌污染常见的有大肠杆菌 ，葡萄球菌等。细菌污染较易发现 ，在普通倒置显微镜下为黑色细沙状 ，培养 液一般会在短时间内变黄 ，有时静置的培养液不混 ，稍加震荡 ，变会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有 大量圆球状颗粒物漂浮 ，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在 ，细胞停止生长并有中毒表现。 处理 ：  在培养液中加入相应的抗生素 ，能够预防绝大多数的细菌污染  保证器皿、水充分灭菌 ，空气无菌 ，同时保证灭菌压力。 2、霉菌 ：霉菌的污染多数是白色念珠菌 ，曲霉菌 ，酵母菌等。霉菌污染后培养液短期内依旧清亮不变浑浊 ，倒置 显微镜下可看见细胞之间有交错的丝状 ，树枝状菌丝 ，漂浮在培养液中。念珠菌呈卵圆状 ，在细胞周边生长。细胞 被霉菌污染后 ，仍可生长 ，长时间细胞的活力状态会变差。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 处理 ：先确定污染物的种类 ：细菌、真菌还是支原体。如果是霉菌污染。迅速将污染细胞与正常细胞系隔离 ，并对 实验中所用过的所有器皿工具消毒 3、支原体 ：支原体的大小介于细菌和病毒之间 ，是一种独立生活的微生物。对热敏感 ，对一般抗生素不敏感。支 原体的形态多变 ，多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察 ，中心有高密度的密集颗粒 ，横断面与细胞微绒毛相 似。 因国内的血清很多数都没有做支原体阴性检测 ，而支原体又是牛血清中最常见 的微生物之一。支原体污染细胞后 ，培养液轻微发生混浊 ．但细胞变化不显著 ， 在细胞逐渐的培养中 ，细胞会慢慢死亡。 支原体污染检测 ： 荧光染色法 ：DNA和与 DNA特异性结合的荧光染料结合 ，使得支原体的 DNA 着色 ，然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表 面的亮绿色小点。 解决 ： 1.抗生素排除法 ：支原体污染预防比解决好。如果不小心污染后 ，可加入高浓度抗生素 （常规使用的 5倍浓度 ）作 用 24-48 小时 ，再换入常规培养液 ，但该法不保证有效。推荐用量 ：庆大霉素 200ug/ml ，四环素 10ug/ml ， 卡那霉素 50ug/ml 。 2.加温除菌 ：支原体不耐热 ，可以对支原体污染的细胞热处理除菌。将支原体污染的细胞放置 41度中作用 10 小时 可杀死支原体。因高温对细胞本身也会产生一定影响 ，故热处理前需先进行预实验 ，确定对细胞影响最小而能最大 程度的杀死支原体的时间。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋白整体方案