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葡萄糖在电极上的安培响应 Hydrodynamic voltammograms 线性范围: 0.1-30 mM，灵敏度为340 nA mM-1 检测限: 0.03 mM (S/N=3)。 Each 2 mM c)第三代生物传感器 理想的第三代生物传感器是在电极表面实现酶与电极的直接电子传递,即: Ered = Eox + ne- 三代生物传感器敏感机理对比 五、电极上酶的固定化方法 酶是酶传感器中的分子识别物质，因此酶在电极表面固定是制备生物传感器的一个非常关键步骤，酶电极的成功与否往往在很大程度上取决于酶的固定。理想的酶固定方法应该满足以下三条标准： i)能保留酶的高活性； ii)酶固定层具有很好的稳定性，如：在一定pH范围内不变性，在溶液中没有泄漏； iii)酶电极能对底物发生快速和灵敏的响应。 经过多年的研究，发展了许多基于物理的、化学的或物理化学方法相结合的酶固定方法。 吸附法 这是一种最为简单的方法，即通过物理吸附(基于离子的、极性的、氢键、亲油性、?-电子作用等作用力)或化学吸附(基于化学反应的分子自组装膜， Self-assembly monolayer, SAM)将酶固定在基体上。 由于没有试剂参与固定过程及这些载体对酶良好的亲和性，该方法最大的优点是生物活性高。然而由于吸附是一个可逆的过程，该方法制备的生物传感器对pH、温度、离子强度、底物浓度很敏感，这些因素可能会导致酶的脱落。 b) 包埋法 这是一种应用很普遍的酶固定化技术，该技术包括碳糊包埋、溶胶-凝胶包埋、电化学聚合膜包埋等。溶胶-凝胶包埋是将酶包埋并固定在一个聚合物三维空间网络结构或孔状结构中，小分子物质能容易地渗透进来。 该方法的缺点是膜的孔径控制不好经常发生酶的泄漏或对底物的扩散速率的消极影响。 ●碳糊包埋法一般是将酶直接固定在修饰电极材料中； ●溶胶-凝胶包埋使用金属醇盐（如TEOS）sol-gel膜； ●电化学聚合膜包埋包括导电聚合物包埋和非导电性聚合物膜包埋。非导电性聚合物膜包埋主要包括聚苯酚、聚硝基酚、聚β- 氨基乙基苯酚、间笨二酚、苯二胺和聚吲哚等。 聚合物包埋 溶胶-凝胶法：溶胶－凝胶(sol - gel) 法是将金 属醇盐或无机盐溶于水或有机溶剂,在低温下通过水解、聚合等化学反应,形成内含纳米粒子的溶 胶,再转化为具有一定空间结构的凝胶。然后经过适当热处理或减压干燥,制备出相应的粉末、薄 膜和固体材料的方法。此法的优点是反应过程易控制,处理温度低,粒径分布窄,纯度高,纳米颗粒分散均匀。但成本昂贵,周期长,产量小,热处理时易团聚且污染环境,难以实现工业化生产。 c) 共价键合法 该方法是通过共价键将酶分子与电极表面结合而固定的方法，虽然这种方法操作较为困难，但由于提供了比较稳定的固定化酶，因而已得到了较为普遍的应用。 共价键合法的主要缺点是酶在共价键合时可能会改变酶的结构，因而共价键合酶的催化活性及稳定性会受到一定程度的影响。 d) 交联法 通过双(多)功能团试剂将酶分子之间、酶分子与凝胶/聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化。这种方法可以克服酶电极在溶液中从电极表面泄漏的缺点。最常用的交联剂是戊二醛，它能在温和条件下与酶蛋白上的-NH2残基反应。惰性蛋白(如：牛血清蛋白，BAS)常用来形成酶膜，因它含有丰富的赖氨基残基，易于和戊二醛作用形成非水溶性的聚合物膜，同时也为酶分子提供了合适的微环境，从而提高了测定灵敏度。 戊二醛和BAS固定酶电极 Glucose oxidase catalysed oxidation of glucose: identification of measurement parameters for glucose assay. 六、免疫传感器  电化学免疫分析法：将免疫法的高选择性与电化学法的高灵敏性结合起来所产生的一种新型的免疫分析法。 电化学免疫分析法包括电化学免疫传感器和伏安免疫分析法。 免疫法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的分析方法。它具有很高的选择性和很低的检测限，可以应用于测定各种抗原、半抗原或抗体。 免疫法有放射免疫法、荧光免疫法、发光免疫法及酶联吸附免疫法等。其中以放射免疫法的灵敏度最高。但由于放射免疫法涉及到示踪原子的处理，使用上受到限制。 将生物学免疫分析法与伏安法相结合，产生了一种新型的免疫分析法——电化学伏安免疫法。 1、伏安免疫分析法 实现伏安免疫法的途径很多。通常按标记方法的不同，分为酶标记法和非酶标记法。 采用酶标记法时，通过酶的催化作用，产生