黄绿青霉素通过溶酶体-线粒体轴引起HepG2细胞自噬依赖性凋亡的实验研究-营养与食品卫生学专业毕业论文.docxVIP

目录一、摘要(一)中文摘要1(二)英文摘要4二、正文(一)前言L一，)日IJ舌．4／7(二)材料和方法81．材料81．1实验对象、药品和主要试剂81．2主要仪器．．92．方法92．1细胞培养和处理．92．2 RNA干扰．1 O2．3蛋白质印迹实验(Western blot)．．102．4吖啶橙染色检测溶酶体膜稳定性132．5 JC．1染色检测线粒体跨膜电位142．6 Caspase-3活性检测．142．7 TUNEL染色检测细胞凋亡．1 52．8统计分析16(三)结果．．161．黄绿青霉素诱导HepG2细胞自噬小体聚集16万方数据2．黄绿青霉素引起HepG2细胞溶酶体膜通透性增加173．黄绿青霉素引起HepG2细胞溶酶体组织蛋白酶D释放增 加194．黄绿青霉素引起HepG2细胞线粒体跨膜电位下降205．黄绿青霉素激活HepG2细胞内Capase一3的活性246．黄绿青霉素诱导HepG2细胞发生凋亡．25 (四)讨论．．26(五)结论29(六)参考文献29三、综述．33(一)文献综述34(二)参考文献．41四、附录44五、攻读学位期间发表文章情况45 六、致谢．46万方数据大连医科大学硕士学位论文黄绿青霉素通过溶酶体．线粒体轴引起HepG2细胞 自噬依赖性凋亡的实验研究硕士生姓名：王月霞 指导教师：陈敏教授 专业名称：营养与食品卫生学一、摘要 (一)中文摘要目的：黄绿青霉素(citreoviridin，CIT)是一种真菌毒素，由发霉谷物中的 真菌(主要为黄绿青霉菌)产生。实验发现，若粮食谷物中的水分达到14．6％， 黄绿青霉菌就开始生长。因而，当储存环境潮湿、时间过长等不利条件时，粮食 中的黄绿青霉菌就生长迅速，发生真菌及其毒素的污染加重。虽然目前粮食的生 产、加工、贮藏工艺越来越科学，其卫生标准的制定和监督机制的执行也愈加严 格并不断完善，但是贮存的粮食仍然遭遇真菌的污染，其发生情况依然较为严重。 目前针对黄绿青霉素的毒性研究都集中在其心脏血管毒性、遗传毒性以及神经毒 性，但是肝脏作为重要的代谢和解毒器官，黄绿青霉素对肝脏毒性的研究却并不 多见，因而其作用机制的探究也就更不明确，这也是本试验对黄绿青霉素毒性机 制探讨的关注点。近年来，随着细胞自噬研究的深入，发现自噬水平过度上调则引起细胞自噬 性死亡，被称为n型程序性死亡，区别于I型程序性死亡一凋亡。虽然从生化代 谢途径和形态学方面来看，两者确实存在着明显的差别。但是，越来越多的数据 表明，它们之间的信号通路存在着广泛的交联。我们以往的实验结果已表明，黄 绿青霉素能诱导人肝癌细胞(HepG2)自噬体形成增多，而本实验目的在于探索 在暴露于黄绿青霉素的HepG2细胞中，自噬与溶酶体膜通透性增加及凋亡之间的 关系。本研究可为探索自噬和凋亡之间的关系提供实验依据，也可更深入地理解】万方数据大连医科大学硕士学位论文黄绿青霉素肝脏毒性的分子机制。方法：之前的实验研究中测定黄绿青霉素作用于HepG2细胞的IC50为7．2 “M，浓度为5 uM时，HepG2细胞的存活率可达到80％。因而本实验中，我们选 择黄绿青霉素的浓度为5 HM，在不同的时间点作用于研究对象—HepG2细胞。 用Westernblot(蛋白质免疫印迹实验)检测经黄绿青霉素处理后，HepG2细胞中 LC3(细胞内自噬标记物．微管相关蛋白轻链3)和cathepsin D蛋白表达量的变化； 用荧光显微镜观察经AO染色的HepG2细胞溶酶体膜稳定性变化；用荧光显微镜 观察经JC．1染色的HepG2细胞的线粒体膜电位改变情况：用分光光度法检测经 黄绿青霉素处理后，HepG2细胞内Caspase．3的活性变化；用TUNEL染色检测 经黄绿青霉素处理后，HepG2细胞是否发生凋亡。预先用自噬抑制剂3-MA (3-Methyladenine，3．甲基腺嘌呤)或siRNAAt95处理后，研究在CIT处理细胞 中，自噬与溶酶体膜稳定性和凋亡的相互关系。用组织蛋白酶D的抑制剂．抑胃 肽预先处理后，研究组织蛋白酶D在CIT所致凋亡中发挥的作用。结果：以浓度为5 uM的黄绿青霉素处理HepG2细胞3 h、6 h、12 h、24 h 后发现，在6 h时，细胞中LC3．II蛋白的表达量与对照组相比己出现显著增高， 并呈时间依赖性升高。而在3 h时LC3．II蛋白的表达量与对照组相比没有显著的 变化。荧光显微镜下观察到黄绿青霉素处理HepG2细胞12 h后，溶酶体膜稳定性下降，通透性增加，并且溶酶体组织蛋白酶D的表达量也在12 h开始增加，而 经过自噬抑制剂3-MA和siRNA At95干预后，在12 h时溶酶体膜通透性增加及 组织蛋白酶D的释放明显被缓解；荧光显微镜下还观察到黄绿青霉素处理HepG2 细胞12 h后，线粒体膜电位开始下降。同样