植物生物学实验(物生理)教案.docVIP

实验一 多酚氧化酶活性测定（3学时） 一、实验目的： 掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制 2、了解植物盐处理的方法 3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法 4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法 5、掌握丙二醛含量的测定方法、原理 ????植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分, 保证植物的正常生长。在植物细胞生理干旱时它的增加有助于细胞或组织水用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 三、实验主要仪器和试剂 仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅 试剂：酸性茚三酮溶液冰醋酸3％磺基水杨酸反应液 四、实验步骤 （一）实验材料的培养 小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。 （二）盐胁迫处理 用200 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。 （三）脯氨酸含量测定 1.标准曲线的制作 用100μg/ml脯氨酸配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3% 磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。 2.脯氨酸的提取 称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，4000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。 3.反应体系 取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。 4. 脯氨酸的含量的计算 从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。 （四）过氧化物酶活性的测定 1.过氧化物酶的提取 称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4℃，4000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液 2.反应体系 25μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔20s记一次数值，连续记录三次，取平均值。 3.酶活力定义 过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min·g （五）丙二醛含量测定 1.丙二醛提取 小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加入10﹪三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)和少量石英砂充分研磨，匀浆液以4000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。 2.反应体系 取2mL提取液，分别加入2mL 0.6﹪TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液调零。 3.MDA含量计算： 根据C＝6.45×A532－0.56×A450，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量(μmol/g（FW)）。 五、思考问题 1.为什么设定重复处理？ 2.分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？ 六、实验报告 主要内容包括：1.实验目的及要求 2.实验主要仪器和试剂 3.实验原理 4.实验步骤 5.实验结果 6.结果分析 7.回答问题 实验三 植物的元素缺乏症—