抗犬细小病毒单链抗体的制备-生物学；微生物学专业毕业论文.docx

摘要犬细小病毒(Canine 摘要 犬细小病毒(Canine parvovims，cpv)是单链DNA病毒，可引发传染病， 使犬表现为出血性肠炎和非化脓性心肌炎等症状。对于疾病的治疗，业内采 用特异性治疗，同时对症治疗、支持治疗予以辅助。对症治疗、支持治疗主 要能减轻呕吐、腹泻、脱水等症状，但不能消除病毒。特异性疗法常采用高 免血清、犬细小病毒单克隆抗体，但高免血清的效价不稳定，单克隆抗体的 制备过程复杂，易引起异源蛋白反应，不能有效的治疗该病。因此本试验在 制备了单克隆抗体的基础上，又进一步制备了单链抗体。 单克隆抗体的制备方法：用PEG浓缩病毒后，经蔗糖梯度密度离心纯化， 免疫老鼠，3次腹腔注射后，测定效价，再加强免疫，3 d后进行细胞融合， 经筛选和亚克隆后，获得了5株杂交瘤细胞，都可以稳定的分泌单克隆抗体。 分别命名为1G4、1E12、2C3、2H9、3F9，检测各细胞株的特性。亚类鉴定 结果表明1E12、1G4、3F9属于IgGl，2C3、2H9属于IgG2a。中和活性鉴 定结果表明3F9具有中和犬细小病毒的活性。因此制备3F9杂交瘤细胞的单 链抗体。 提取3F9的总RNA，反转录获得cDNA链，并以此为模板扩增重链可变 区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因，利用SOE PCR方法连接VH基因和VL 基因，同时引入(Gly4Ser)3连接肽序列，扩增得到大小为765 bp的单链抗体 (ScFv)基因。将ScFv基因连接至原核表达载体pET-32a(+)，构建成重组质粒 pET-32a-ScFv，转化至BL21(DE3)感受态细胞，并在37℃条件下进行IPTG 诱导表达，得到融合蛋白。经SDS．PAGE分析大小约为46 kD，与预期结果 相符。经Western—blotting鉴定该蛋白能被抗His标签的单克隆抗体特异性识 别。间接ELISA试验以及中和试验结果表明，ScFv能够与犬细小病毒结合， 具有中和犬细小病毒的活性。 试验获得了5株能稳定分泌抗CPV单克隆抗体杂交瘤细胞株，成功扩增 杂交瘤细胞株3F9的ScFv基因，并实现了原核表达，为探索CPV的防控打 下了基础。 关键词：犬细小病毒；单克隆抗体；单链抗体；原核表达；滑陛鉴定 万方数据 ABSTRACTCanine ABSTRACT Canine Parvovirus(Canine parvovirus，cPv)，a single—stranded DNA virus， Call cause a potent infectious diseases，SO that the dogs show hemorrhagic colitis and non—suppurative myocarditis and other symptoms．For the treatment of diseases，industry preclude the use of specific treatment，and symptomatic treatment，supportive care to be assisted．Symptomatic treatment and supportive treatment can reduce major vomiting，diarrhea，dehydration and other symptoms， but can not eliminate the virus．Preclude the use of more specific therapy hyperimmune serum，canine parvovirus monoclonal antibody treatment,but hyperimmune serum tffer is unstable，and the preparation of monoclonal antibodies has a complex process and here is a heterologous protein response．All these make tlle treatment of the disease limited．Therefore．the test aimed at preparation of single chain antibody on the basis of monoclonal antibodies． Preparation of monoclonal antibodies：Concentrated the virus by PEC4 then purified by sucrose densi锣gradient centrifugation，and in