麦长管蚜G蛋白β和γ亚基的基因克隆及其相互作用蛋白的筛选-农业昆虫与害虫防治专业毕业论文.docx

摘要G蛋白偶联信号传导系统是生物体内一类重要的细胞信号传导途径。其在高等动物、简单真 摘要 G蛋白偶联信号传导系统是生物体内一类重要的细胞信号传导途径。其在高等动物、简单真 核生物、昆虫及植物中普遍存在。国际上。以果蝇为模式昆虫。对G蛋白的结构与功能作了较多 的研究，证实G蛋白参与了昆虫的嗅觉、视觉和内分泌激素等多种信号的传导过程。但是，目前 对其它昆虫G蛋白及其信号传导途径的研究报道很少．针对一些重要害虫的研究更少。开展昆虫 G蛋白偶联信号传导途径研究．不仅可以明确昆虫对信号分子的感受机理，还可以阐明影响G蛋 白偶联信号传导途径某个环节的阻碍机制，为今后深入研究病虫害信号传递机制和调控机理奠定 理论基础。本文选择小麦上的重大害虫麦长管蚜作为实验材料，剩用RT-PCR技术及RACE方法 进行异源三聚体G蛋白13和Y甄基的基因克隆，并利用酵母双杂交系统研究已克隆的麦长管蚜B 和T亚基之间是否互作．并筛选与其相关的作用蛋白。本研究取得如下主要结果： (1)从麦长管蚜中首次克隆了G蛋白p和7两个亚基基因。已被GenBank数据库收录．登录 号分别为AY205294和AY339875。克隆的B亚基与网比亚按蚊(Anopheles gambiae)和果蝇 (Drosophila melanogaster)的G蛋白BI亚基氨基酸序列同源性达90％．与哺乳动物B2型亚基的 同源性为80％，具有一个由7个WD--40(色氮酸一天冬氨酸，WD)重复片断组成的保守区；克 隆的7亚基与果蛹脑中表运的T】亚基氨基酸同源性为60％，与哺乳动物亚型的同源性为38 ％，具有GG“G protein gamma subunit-like motifs。GGL)保守区，C一末端具有4个氨基酸CAVI 保守基序。根据氨基酸序列同源性比较结果，初步推测克隆的麦长管蚜B和Y亚基与果蝇的Bl 和T1旺型、哺乳动物的B2和丫7亚型相似。 (2)用半定量RT-PCR方法对麦长管蚜G蛋白B和Y亚基基因进行了组织和虫期的转录平研 究。结果表明．两个亚基的基因在麦长管蚜各虫期及头、胸和腹部都能转录，且头部的转录水平 最高。麦长管蚜G蛋白B和T亚基的这种组织分布广泛性，可能预示其参与细胞的多种信号传导 途径。 (3)通过构建麦长管蚜的eDNA文库，用克隆的B亚基做诱饵进行酵母双杂交筛选，得到与 其相互作用的蛋白。共鉴定了120多个阳性克隆，对40个具有代表性的克隆进行测序。通过 GenBank查询和分析，发现13个克隆分别与G蛋白受体激酶7(GPRK7)、G蛋白偶联受体 126((／PRl26)、核糖体蛋白等基因序列部分同源，其它的克隆序列在GenBank中未查到相似基因， 可能是一些尚未公布的新基因片断。这些克隆的获得，为进一步研究麦长管蚜G蛋白8亚基在信 号传导中的作用奠定了基础。用克隆的1亚基做诱饵仅筛到了7个阳性克隆，在GenBank中没有 查到与之类似的基因，有待进一步鉴定。 (4)用酵母双杂交系统研究克隆的麦长管蚜G蛋白B和Y亚基之间是否存在互作。在生物体 内，G蛋白9和T亚基只有结合成二聚体才具有信号传导的功能。本试验没有筛到相互作用的阳 性克隆·可能是克隆的这两个亚基之间不能结合或结合力很弱，推测麦长管蚜中可能存在其它亚 型的D和T皿基，有待进一步试验证明。 (5)克隆了麦长管蚜小G蛋白Rho家族Cdc42的基因．在GenBank中的登录号为AY581120。 Cdc42也是一类结合GTP且具有OTP酶活性的信号传导蛋白，它能通过调节细胞骨架肌动蛋自 的聚合来控制昆虫翅脉(Crossveins)的分化。通过半定量RT-PCR方法研究发现．麦长管蚜Cdc42 的聚合来控制昆虫翅脉(Crossveins)的分化。通过半定量RT-PCR方法研究发现．麦长管蚜Cdc42 基因在不同组织及各虫期均能转录，一龄若蚜就有较高的转录水平，且若蚜期高于成蚜期，有翅 蚜高于无翅蚜。这些结果表明，Cdc42基因具有时空转录的特异性，在翅脉的分化过程中起正调 控作用．由此推测翅脉的分化可能从一龄若蚜期开始。 (6)克隆了麦长管蚜肌动蛋白基冈的部分eDNA序列。获得了四个阳性克隆，通过序列比较 分析。将核苷酸序列差异较大的克隆actinI和actin2在GenBank中登记，登录号分别为AY581121 和AY581122。GenBank搜索结果发现，与所有已知的肌动蛋白氨基酸同源性都在94％以上。该 基因的分离为深入研究小G蛋白Cde42，如何通过调节细胞骨架肌动蛋白的聚合来调控翅脉的分 化奠定了基础。 通过本文研究，首次从麦长管蚜中分离和克隆了G蛋白及其与信号传导途径相关蛋白的基因 5个。通过转录水平的研究证实，克隆的G蛋白p和T亚基属于广泛组织分布型，可能参与细胞 多种信号途径的传