抗除草剂草甘膦抗虫双抗转基因棉花的创制-遗传学专业毕业论文.docx

堕垄塑主生盔堂苎圭兰堡笙兰!垫堕苎型苎苎鳖垫皇矍垫茎茎圈塑垄竺型!L——一抗除草剂草甘膦抗虫双抗转基因棉花的创制 堕垄塑主生盔堂苎圭兰堡笙兰!垫堕苎型苎苎鳖垫皇矍垫茎茎圈塑垄竺型!L——一 抗除草剂草甘膦抗虫双抗转基因棉花的创制 专业：遗传学 博士生：谢龙旭 导师：徐培林教授 摘要 本论文研究的目的是将草甘膦抗性基因aroAMl2和抗虫基因BtSIm导入到具有优 良性状的陆地棉棉花品种中棉35号、鲁棉6号和石远321中，获得抗草甘膦抗虫双抗 棉花转基因植株，并对获得的转化植株遗传稳定性进行分析，为培育拥有我国自主知 识产权的转基因棉花产品奠定基础。 棉花是重要经济作物之一，由于受杂草的威胁，导致其产量和质量严重下降。草 甘膦作为除草剂Roundup@的活性成份，具有广谱、高效、低毒、杂草难以产生抗性等 特点，是一种理想的除草剂。其作用机理主要是通过抑制芳香族氨基酸合成途径中的 5-烯醇式丙酮酸莽草酸一3．磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate．3．phosate synthase．EPSP 合成酶)的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，最终杀死杂草和作物。利用基因优 化方法(DNA shuffling)重组大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏杆菌 (Salmonella typhimurium)EPSP合成酶基因，获得了突变的aroAMl2基因，其表达的 产物EPSP合成酶对草甘膦的亲和力明显降低，对PEP的结合能力明显升高，从而大幅 度提高了酶对革甘膦的抗性。在aroAMl2基因上游连接了来自花椰菜花叶病毒 (Cauliflower mosaic virus)的35S启动子(CaMV35S)和来自拟南芥EPSP基因转运 肽ASP(Arabidopsis signal peptide)的核苷酸编码序列，以使aroAMl2能够在棉花体 内高效表达，并且使表达的EPSP合成酶运输到其作用场所叶绿体。 除了杂草，虫害也是棉花生产上一大亟待解决的难题。来自苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis，Bt)的研是最常用的杀虫基因。苏云金芽孢杆菌在形成芽孢 时，产生杀虫蛋白OcP)，能特异性地杀死鳞翅I了(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)或鞘翅 (Coleptera)等昆虫的幼虫。其杀虫机理是Bt蛋白活性毒素片段与敏感昆虫肠道上的 谢龙旭 谢龙旭 中山大学博士学位论文： 抗除草剂草廿膦抗虫双抗转基因棉花的创制 特异性受体结合，在中肠细胞膜上形成离子通道，细胞由于渗透平衡被破坏而破裂， 导致昆虫最终死亡。但是由于厨基因来自于细菌，在植物中不能很好的表达。本研究 采用的BtSlm基因是根据天然Cry I Ac和Cry I Ab的氨基酸序列和植物优化密码子的 原则人工合成的。启动BtSlm基因表达的是含有加倍增强子的2E一35S启动子。在BtSlm 基因上游嵌合一段来自烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)RNA5 7端非翻译区 的引导序列f2片段，起增强翻译作用。紧接BtSlm基因上游连接了一段来自烟草致病 相关蛋白的转运肽伊athogenesis。relatedprotein，PRlb)编码区序列，使表达的杀虫蛋白分 泌到细胞外。 通过分子克隆技术将aroAMl2和BtSlm基因表达框整合到基础载体 pCAMBIAl300上，构建成植物高效表达双元载体pAMl2．Slm，利用农杆菌介导法将 aroAMl2和BtSlm基因导入到棉花中，并以aroAMl2基因作为选择标记，直接用草甘 膦进行抗草甘膦、抗虫转基因棉花植株的筛选。为了大量获得转化植株，本研究建立 了棉花高效组织培养植株再生体系。 本研究接种中棉35号、鲁棉6号和石远321下胚轴外植体数分别为280、248和 215块，得到的再生棉株数为42、89和75株。对获得的再生植株进行PCR分子检测 发现，所有的棉花再生植株aroAMl2基因均呈阳性，阳性率为100％。中棉35号转化 率最低，为2．50±0,05％1鲁棉6号转化率最高，为8．06±0．37％：石远321转化率仅 次于鲁棉6号，为7．44±O．32％。携带有外源基因的T-DNA在向棉花基因组整合过程 中大约有30％的BtSlm基因丢失。Southern杂交结果显示，在所得到的中棉35号、 鲁棉6号和石远321转基因棉花中，含单拷贝的植株最多，分别为70．O％、55．0％和 65．0％。Northern杂交中分别出现了1．3 kb和1．9 kb大小的转录条带，表明aroAMl2和 BtSlm基因在转录水平上进行了正确的表达；Western杂交中分别出现了45 kDa和68 kDa大小的蛋白迁移条带，表明两个基因在棉花植株体内进