抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物的高通量筛选方法的建立-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 不 如需保密，解密时间 年 月 Et 是否保密 也 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下迸行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此迸行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均巳在论文中做了明确的说明，莠表示了谢意。 研究生签名：蒜土字 时间： 知li 年 f月『o 目 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关亍保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以周不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注；保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权书。 学位做作髅名：档 锄％、可枕 签名暑期：2jD}6午i月f0日 签名日鬏： 瑚锌《月哆雪 万方数据 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物的高通量筛选方法的建立目录 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物的高通量筛选方法的建立 目录 摘 要 i ABSTRACT ．．． ．．．iii 缩略语表(Abbreviation) v 第1章文献综述 ．1 1．1猪繁殖与呼吸综合征病毒简介 1 1．2 PRRSV分子生物学 】 1．3猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测和防控 5 】．3．1临床诊断 5 1．3．2血清学诊断技术 5 1．3．3病毒分离 6 1．3．4逆转录聚合酶链式扩增技术 6 1．3．5逆转录环介导等温扩增技术 ．7 1．3．6 PRRSV的防控 7 1．4新型抗蓝耳病毒药物检测方法的建立 8 1．4。1双荧光素酶报告系统 ．8 1．4．2内含肽介导的生物传感器的构建 10 第2章 目的与意义 12 第3章材料与方法 1 3 3．】实验材料 ．1 3 3．1．1菌种、细胞 ．．1 3 3．I．2载体构建所需材料及获赠载体 ．．1 3 3．1．3相关引物 一13 3．1．4工具酶及主要试剂 ．．1 4 3。1．5相关试剂的配制 一l 5 3．1．6主要实验仪器及设备 一16 3．1．7分子生物学分析软件 ．．1 7 3．2实验方法 ．1 7 3．2．1聚合酶链式反应(PCR) 17 3．2．2限制性内切酶酶切反应 一1 7 3．2．3 PCR或酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测 1 7 3．2．4 PCR或酶切产物的回收与纯化 l 8 312．5外源DNA片段与载体的连接反应 1 8 3．2．6大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) ．．】8 3．2．7连接产物的转化 ．．1 9 万方数据 华中农业大学2016届硕士学位论文3．2．8重组质粒的小量制各 华中农业大学2016届硕士学位论文 3．2．8重组质粒的小量制各 1 9 3．2．9重组质粒的鉴定 1 9 3．2．10质粒中提 ．19 3．2．11细胞转染实验(脂质体介导转染法) ．19 3．2．12荧光素酶报告基因实验 ．20 3．2．1 3 Western Blot检测目的蛋白的表达 ．2】 3．2．1 4空斑实验 ．22 3．2．1 5统计学方法 ．．22 第4章结果与分析 23 4．1荧光素酶生物传感器表达质粒的构建 一23 4．2筛选最优的报告质粒 ．．24 4．2．1报告质粒的效果验证 24 4．2．2报告质粒的敏感性验证 25 4．2．3报告质粒358D．Nsp3／4的特异性验证 27 4．3抗PRRSV药物的筛选 32 第5章讨论与结论 35 5．1讨论 ．．35 5．1．1双荧光素酶报告系统的选择 35 5．1．2 PRRSV非结构蛋白切割序列的选择 ．．35 5．1．3萤火虫荧光素酶突变体的选择 36 5．1．4 Npu DnaE内含肽的选择 38 5．1．5抑制PRRSV增殖的药物筛选以及验证 39 5．2结{念 ．．39 参考文献 40 至芟{射 一49 万方数据 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物的高通量筛选方法的建立摘要 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物的高通量筛选方法的建立 摘要 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一 种以妊娠母猪繁殖障碍和生长仔猪呼吸道症状为主要临床特征的传染病，其病原