枯草芽胞杆菌高产聚—γ—谷氨酸及其应用研究-微生物学专业毕业论文.docx

2005年毕中农业人学博I’学位论文摘要 2005年毕中农业人学博I’学位论文 摘要 本文优化了分别以猪粪、奶牛粪为主要原料固体培养专利菌株枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis CCTCC202048)高产聚一Y一谷氨酸(7-PGA)的工艺，对7-PGA进 行了初步表征，研究了7-PGA的流变特性和降解特性，探讨了7-PGA保肥增效的 作用和机理，揭示了7-PGA对生物农药苏云会芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt) 制剂的保护作用。 应用3个正交试验优化了以猪粪为主要成分固体培养B．subtilis CCTCC202048高 产T—PGA的工艺。优化培养基配方为：猪粪62．3％(w／w，干重)，黄豆饼粉25．0％， 麦麸5．0％，谷氨酸5．0％，柠檬酸2，5％，MnS04,H20 0．2％；优化培养工艺为：装料 量15．0 g，含水量60％，对数中期接种，接种量4％，初始pH9．0，培养温度37℃，时 间48 h。优化试验中，平均T．PGA产量为6．O％，氨态氮从3．3％o降到0．7％o，全氮、全 磷、全钾的变化不明显。速效磷、速效钾的含量略有增加。将优化培养基配方用于 野外堆肥试验，y-PGA的平均产量为4。5％。本研究结果将在减少猪粪的污染，增加 猪粪肥效和丌发一种新型的保水保肥的有机肥料方面打下坚实基础。 应用响应面方法对以奶牛粪为主要成分固体培养B．subtilis CCTCC202048高产 ／-PGA的培养基进行了优化。首先用Plackett．Burman方法对相关影响因素的效应进行 了评价，并筛选出了有显著正效应的黄豆饼粉、麦麸和谷氨酸。随后用Box．Behnken 实验和响应面分析方法确定了优化培养基配方：奶牛粪56．32％(w／w，干重)．黄豆 饼粉23．35％，麦麸16。08％，谷氨酸4．25％：用哐交试验优化的最佳发酵条件为：装料 量15．0 g，含水量60％，对数中期接种，接种量8％，初始pH9、0。培养温度40℃，时 间48 h。在优化条件下，平均Y．PGA产量为4．98％，氨态氮含量从2f3‰降到O．66％o， 全氮、全磷、全铡的变化不明显，速效磷、速效钟的含量略有增加。优化结果与实 际发酵情况吻合较好。将最佳培养基配方应用于野外堆肥试验，7-PGA的平均产量 为3．58％。本工艺在奶牛粪的无害化处理、提高奶牛粪肥效、改善有机肥料的保水保 肥能力方面有良好的前景。 采用UV、HPLC、FT-IR和NMR等多种测试手段对B subtil括CCTCC202048 代谢产物Y．PGA进行了初步表征。供试样品经水解后。HPLC色谱图出现一个峰， 与谷氨酸相同，说明其仅由谷氨酸聚合而成；红外光谱图的特征吸收峰与标准品一 致，表明两者具有相同的化学结构，初步确定试验精制产品为y-PGA。7-PGA的核 磁共振氢谱图进一步说明y-PGA由谷氨酸组成。 不同浓度、温度和pH值下．对7-PGA流变特性的研究证明7-PGA溶液为非牛 顿流体，有剪切变稀现象。在20．50(2范围内，粘度随温度的升高呈指数递减，在 50—70。C范围内，粘度随温度的升高下降趋势减缓。粘度隧T．PGA溶液浓度增加呈 指数形式增加。在pH5一11，粘度较稳定，7-PGA溶液表观粘度对酸度更为敏感，在 枯学芽胞杆菌商产聚一Y．符氮艘驶其)世用研究碱性条件下相对稳定。盐浓度和种类对7-PGA溶液表观粘度影响显著。所得结果将 枯学芽胞杆菌商产聚一Y．符氮艘驶其)世用研究 碱性条件下相对稳定。盐浓度和种类对7-PGA溶液表观粘度影响显著。所得结果将 为B,subti胁CCTCC202048的发酵生产和y-PGA工业应用提供理论依据。 ?-PGA可在热、酸、碱和超声波处理下降解，在降低7-PGA分子量的同时，能 有效减小7-POA分子量分布的分散性。7-PGA在环境水样中的降解较弱，不同浓度 的7-PGA在环境水样降解速度差别不大，7-PGA的降解主要来自于非生物因素，水 样中微生物对7-PGA降解的影响不显著。7-PGA在环境士样中降解较快，7-PGA在 灭菌土壤中降解的半衰期是未灭菌土壤的3．7倍，这说明7-PGA在环境土样中的降 解主要是微生物的作用。从土壤中分离的高产7-PGA的微生物B．subtilis CCTCC202048能降解y-PGA，通过PCR扩增得到了?-PGA降解酶基因。研究结果 说明Y．PGA具有环境友好特性，在农业生产和改善环境方面有良好的应用前景。 在Y．PGA浸种的发芽试验中，小白菜、小麦、玉米、棉花等种子的芽长、根长、 发芽系数、淀粉酶活力和过氧化氢酶活力等均有不同程度的提高。泌明Y．PGA浸种 可以提高种子活力。 1,-PGA能提高小白