萝卜细胞质雄性不育胞质和核基因的分子标记的开发及其分子特征-蔬菜学专业毕业论文.docx

二0 二0 0六年华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究_q2作及取得的研究 成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地3-外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均己在论文申敛了明确的说明，并表示了谢意． 研究生鼢≥丕如节 帆彬午乒月，移日 学位论文使用授权书 学位论文作者锨多始辛 铷始刁狮’ 签名日期：≯卯多年刍月f易日 签名日期：2，PZ年占月，矽日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 摘要萝h(Raphanus 摘要 萝h(Raphanus sativus L．)足深受世界人民喜爱的根菜类蔬菜。萝h的杂种优 势非常显著，能够有效地提高产量和改善纤维品质．在植物中，细胞质雄性不育 (Cytoplasmic male sterility，CMS)是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状， 被广泛地应用于商业化生产Fl代杂种。萝卜CMS系的细胞质即能导致萝卜届植物 雄性不育，又能导致芸藿属植物雄性不育，而且其CMS不易受环境条件和不同遗传 背景的影响，从而是十字花科植物中最受关注的不育细胞质之一。目Ij{『已有一种萝 卜CMS及其对应的恢复位点从萝卜导入到油菜中，但一些不良的农艺性状随着恢复 基因的导入而出现。远期目标在于阐明萝卜CMS及育性恢复以及使萝卜CMS在十 字花科杂种优势育种中得到充分利用。本篇论文中，我们就萝卜CMS胞质不育和核 基因的分子标记及其分子特征进行了描述．取得的主要研究结果如下： 获得了一个萝卜CMS系统，该系统由雄性不育系9802A、保持系9802B和恢复 系9802H组成。该不育系花药外观铍缩或正常，无可见花粉，而Ogu CMS系花药 外观皱缩未完全发育；NWB CMS系则花药外观正常、花药内有部分花粉。不育系 9802A和恢复系9802H杂交产生的FI植株全部表现雄性可育，表明CMS的恢复表 现型足一种显性性状。获得了由300个荤株组成的F2代育性分离群体。卡平方测验 表明分离群体中可育与不育的分离比符合3：1的比例，证明9802A雄性不育的育性 恢复受单一显性基因控制。 用萝卜Ogu orfl38基因的特异引物组合ORF．F和ORF．R，在萝h CMS系 9802A总DNA中扩增出了一条DNA片段，而在保持系9802B和恢复系9802H中 未扩增出任何产物。序列分析表明该片段与特异诱导Ogu CMS相关基因orft38序 列完全一致。该DNA片段可以作为选育萝卜CMS的分子标记。 合成了能够扩增出萝卜NWB CMS系的特异分子标记的引物组合NWB．F和 NWB．R，该引物组合在萝h CMS保持系9802B和恢复系9802H总DNA中扩增出 了单一DNA片段，而在CMS系9802A总DNA中末扩增出任何产物。该DNA片 段可以作为辅助选育萝卜CMS保持系的分子标记。 采用混合分群分析法和F2代的300个单株筛选了萝卜CMS恢复基因冠加的 RAPD标记。对100条RAPD引物的扩增产物进行筛选后，发现RAPD标记 OPC06·1900与恢复基因R加连锁。通过分子克隆和核苷酸测序将该RAPD标记转 换成了显性的SCAR标记SCC06．1894。BLAST搜索表明SCC06．1894与拟南芥和 甘蓝硫酸盐转运蛋白基因的对应区域高度同源。设计了等位特异引物，扩增出了 SCAR标记SCC06-415。用F2代的分离群体进行PCR分析及序列分折表明 SCC06．1894和SCC06-415等位，与R加，咖的遗传距离为8．0 cM。根掘一个萝卜 4 细胞质雄性不育恢复基因mRNA的序列信息，设计了9条引物。采用混合分群分析 细胞质雄性不育恢复基因mRNA的序列信息，设计了9条引物。采用混合分群分析 法筛选这些引物构成的引物组合，鉴别出了3个多态性带，这3个PCR分子标记相 互问处于相引相，且共分离，与恢复基因足加遗传距离为1．4 cM。以上的特异的分 子标记分布在恢复基因跏的两翼有助于选育新的油菜恢复系。 通过PCR、RT-PCR和测序发现了与Ogu CMS恢复基因Rfo完全一致的mRNA 及基因组序列。基于以上结果，推断恢复基因跏与Rfo处在萝卜基因组的不同区 域但紧密连锁(遗传距离为1．4 eM)。首次通过分子标记手段鉴定出了萝卜CMS新 的恢复位点。 通过RT-PCR和RACE技术克隆出了Rfo．1ike基因的eDNA，推导的氨基酸序列 与Rfo蛋白拥有97％的一致性。RT-PCR分析表明Rfo．1ike基因在萝卜