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第42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)　 研究报告 第9 期 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 2014 年9 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1348 ~1353 DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140103 污染土壤中主要石油降解基因AlkB和 Nah定量检测方法的建立和应用 ∗ 刘庆龙　 唐景春 　 万晓彤 (南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室, 天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津300071) 摘　 要　 建立了SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time-qPCR)检测油田污染土壤中烷烃降 解基因AlkB和萘降解基因Nah 的方法。 比对相关降解石油菌株的GenBank序列,设计合成针对烷烃和萘降 解基因扩增引物AlkBf/ AlkBr和Nahf/ Nahr。 将纯化的常规PCR胶回收产物与pEASY-T1载体连接,转化到感 受态细胞培养。 提取并梯度稀释阳性克隆质粒,构建Real Time-qPCR标准测定曲线。 25 μL扩增体系最佳反 × 应条件:前后引物终浓度为0.2 μmol/ L,12.5 μL2 TransStart Top Green qPCR SuperMix,AlkB和Nah基因最 适退火温度分别为50 ℃和57 ℃。 Real Time-qPCR技术显示出很高的灵敏性和重复性,比传统PCR技术灵 敏度高100倍。 对采集于某油田3个功能区的14土壤样品中AlkB定量检测显示,石油污染严重的采油区含 有最高的AlkB拷贝数,污染较轻的生活区AlkB拷贝数最少;Nah基因分布均匀。 关键词　 石油烃降解基因;荧光;聚合酶链式反应;SYBR Green I;烷烃降解基因;萘降解基因 1　 引　 言 6 × 石油污染是世界性公害之一,全世界每年排入到环境中的石油污染物约为8 10 t。 我国每年约有 5 6 2 [1,2] × × 6 10 t原油汇入环境,造成3.3 10 hm 的土壤面积受到石油污染 。 石油污染物主要为烷烃和芳 香烃,具有很强的生物毒性和环境破坏性[3~5]。 烷烃单加氧酶和芳香烃末端双加氧酶分别由烷烃和芳 香烃降解基因编码,是微生物代谢石油组分的主要酶系。 运用分子生物技术实时定量聚合酶链反应 [6,7] (Real Time-qPCR)对石油降解基因的定量分析可以反映微生物修复石油污染土壤的潜力 。 目前,运用荧光探针和荧光引物的定量PCR检测石油降解基因技术虽然特异性高,但操作复杂、成 本高。 Real Time-qPCR技术利用荧光信号积累对未知模板进行定量分析,具有高效率、高通量、高敏感 性、易操作等优点,在治理油田污染土壤中具有重要应用价值[8~10]。 针对石油组分复杂性,本研究采用SYBR Green I荧光染料Real Time-qPCR技术,建立一种对油田 污染土壤中烷烃降