免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析.pptxVIP

免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析;免疫组化（IHC）的应用介绍 免疫荧光（IF）的应用介绍 流式细胞术（FC）的应用介绍 IHC、IF、FC区别与联系;免疫组织化学原理及特点 利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。 免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。;;组织切片/芯片制作;2. 组织芯片应用领域 组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的基础研究、临床研究、应用研究和新药开发等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅助的cDNA杂交。;免疫组化流程示意图;2. SP法 原理：根据生物素(Biotin) 与??霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后，生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记的链霉亲和素复合物。 特点：该法孵育时间短（通常为10min），灵敏度高以及低背景染色等特点。;IHC常用酶标二抗原理示意图;2. AEC显色法 产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC显色原和与之配套的稀释液。 试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）;免疫组织化学结果分析;2.非特异性显色 石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的次数与冲洗时间。 组织富含内源性的生物素与过氧化物酶，建议使用相关试剂进行封闭。 发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。;免疫荧光原理及特点 免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。 免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。;免疫荧光原理示意图;免疫荧光实验过程;免疫荧光结果分析;免疫荧光双染色抗体的选择;细胞核衬染染料： DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。 Hoechst 33342 是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫外激发光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色。 碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。 细胞浆衬染染料： 鬼笔环肽（phalloidin ）由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂。 荧光抗体的选择： 绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。 红色荧光素：PE，Alex546等。;2.信号弱或无信号 无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞或组织。 细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时间或浓度。 一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。 二抗选择错误（种属不匹配），建议选用与一抗种属相匹配的二抗。;流式细胞术定义及原理 流式细胞仪（FLOW CYTOMETOR）： 进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）: 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。;;流式细胞仪工作原理图;流式细胞术实验过程;人外周全血细胞双参数散点图;散点图：多参数分析;荧光补偿示原理;荧光补偿示意图;Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理;图片引自 /experiment/cellular4/80861.sht