绵羊BLG基因调控人胰岛素原乳腺表达载体构建与转基因表达的分析-生理学专业毕业论文.docx

中国农业大学博士学位论文摘要 中国农业大学博士学位论文 摘要 一I 、憾题背景与研究目标转基因动物乳腺表达受转移基因的结构和整合位点等 多种复杂因素的影响，由于目前还无法实现家畜转基因的定点整合，因此主要 通过不断改进乳腺表达载体结构来提高外源基因的表达效率。针对当前转基因 动物乳腺生物反应器在载体构建理论和分析检测手段上存在的问题，本论文确 定了以下四个研究目标：1、构建以4．2kb和2．1kbBLG5’、3’调控区为基础的 乳腺表达载体。2、建立以GFP为报告基因的乳腺表达定性、定量检测技术， 用于乳腺表达载体构建合理性的快速评价。3、构建BLG调控的两种不同polyA 结构的人胰岛素原乳腺表达载体，分析不同来源的polyA及其上游UTR序列对 乳腺表达效率的影响。4、建立一个敏感、准确、简捷、稳定的转基因动物检测 和鉴定技术体系。通过上述研究，期望克服转基因家畜乳腺生物反应器研制的 几个理论和技术障碍，为乳腺表达载体的构建提供新的理论依据，为转基因动 球蛋白基因调控序列指导外 系统研究了以4．2kb BLG5’ 调控区和和2．1kbBLG 3’调控区为基础构建的绿色荧光蛋白基因和两种不同结 构的人胰岛素原基因在乳腺细胞和转基因小鼠及转基因山羊乳汁中的表达，并 建立了PCR结合酶切分析检测和鉴定转基因动物的技术体系。 f ～一√在BLG乳腺表达载体构建研究中，首先从绵羊基因组DNA扩增并克隆了 4．2kb BLG 5’和2．1kb BLG 3’调控区，并以此为基础构建了pBLG5r_pBLG3f 乳腺表达载体。将该载体与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合后构建了BLO．GFP 乳腺表达快速检测报告基因。经脂质体转染转化乳腺细胞系(TD47)，在荧光 显微镜下观察到GFP在细胞内产生的荧光，同时在细胞培养液中通过定量荧光 检测仪测定GFP在395nm特定波长的紫外吸收，对GFP在乳腺细胞的表达进 行了定量分析。研究表明，所构建的pBLG5f-pBLG3f乳腺表达载体能够调控外 源基因在乳腺细胞获得有效表达；GFP作为报告基因不仅可以用于乳腺表达载 体的定性分析，而且可以对表达效率进行定量分析。 转基因动物乳腺表达人胰岛紊原的研究在人胰岛素原乳腺表达基因构建及其转基因动物乳腺表达的研究中，首先 转基因动物乳腺表达人胰岛紊原的研究 在人胰岛素原乳腺表达基因构建及其转基因动物乳腺表达的研究中，首先 从人的基因组中扩增并克隆了hlNS I和hlNS II两种不同结构的人胰岛素原 基因组DNA。经序列分析证实，克隆的hlNS I和hlNS II与发表序列一致。 hlNS I包含了从起始密码ATG到终止密码TAG，全长1118bp基因组序列； hlNS II的5’端始于起始密码ATG，3’端终止于Poly A加尾信号末端，全长 1179bp。hINS I和hINS 11分别与pBLG5r_pBLG3f乳腺表达载体融合后构建了 两种人胰岛素原的乳腺表达结构：BLG—hlNS I和BLG—hlNS II。该表达结构 包括4．2kb BLG 5’调控区和2．1kb BLG 3’调控区，以及两种不同结构的人胰 岛素原基因组DNA。 用BLG—hlNS I和BLG—hlNS II基因分别注射小鼠受精卵原核，通过PCR 和限制性内切酶检测分析，获得3只带有BLG—hlNS I(2只早，1只6)和5 只带有BLG—hlNS II(2只早，3只6)的转基因小鼠。通过放射免疫(RIA) 试剂盒检测，两只整合了BLG—hlNS I基因的母鼠乳汁中人胰岛素原的表达量 为34．183n#ml和15．53n∥ml。另两只整合了BLG—hlNSⅡ基因的母鼠乳汁中人 胰岛素原的表达量达到37．441ag／ml和39．99Pg／ml。结果说明，BLG—hlNS II转 基因小鼠乳汁中人胰岛素表达量比BLG—hlNS I高1000倍以上。 用BLG—hlNS II注射山羊受精卵原核，获得两只转基因山羊，通过激素诱 导泌乳，对其中一只转基因山羊乳汁进行放免检测和HPLC分析，乳汁中人胰 岛素原的表达量最高达到50．8垤／ml。随后，表达水平随泌乳期的延长而不断下 降。 在转基因动物检测和鉴定方法上建立了特异性扩增及其产物酶切的技术 体系，并对PCR引物设计、参数确定、设立内源性标记等进行了改进和优化。 该方法与单一的PCR方法相比较，更为准确、可靠：与经典的soutllem杂交相 比，操作简便、灵敏、重现性好。 结论通过本论文研究工作可以得出以下结论： 1、以4．2kb BLG 5’和2．1kb 3’调控区构建的乳腺表达结构能够调控外源基因 在乳腺细胞和转基因动物乳腺中表达。 2 中国农业大学博士学位论文2、用GFP构建的BLG—GFP乳腺表达报告基因为乳腺表达的