抗老年痴呆海洋药物971抗Aβ神经毒性及作用机制的研究-水产品加工与贮藏工程专业毕业论文.docx

抗老年痴呆海洋药物971抗AB神经毒性及作用机制的研究抗老年痴呆海洋药物97 抗老年痴呆海洋药物971抗AB神经毒性及作用机制的研究 抗老年痴呆海洋药物97 1抗AB神经毒性 及作用机制的研究 摘要 海洋寡糖971(以下简称971)是中国海洋大学海洋药物与食品研究所从褐 藻中提取分离，并经降解得到的具有特定分子骨架的低分子海洋酸性寡糖类化合 物，平均分子量为1300 Da。目前，按照国家新药研究的规范要求，已完成了所 有临床前的药学及部分生物学研究内容。临床前药效学研究结果显示，971对 A[325．35脑室注射、D．半乳糖皮下注射所致老年痴呆(Alzheimer’sdisease，AD)动 物模型的学习记忆功能均有明显改善作用，并且具有易透过血脑屏障、毒副作用 低等特点。为了进一步阐明971改善AD动物学习记忆功能及其作用机制，本文 以Ap作为研究靶点，观察了971对ABl郴侧脑室注射所致AD动物模型学习记 忆功能的影响：并且体外观察了971对A[3损伤神经细胞的保护作用：在细胞和 分子水平上进一步探讨了971抗A[3毒性损伤的作用机制。 1．971对ADlm侧脑室注射所致AD动物学习记忆功能的影响 利用A13l舶侧脑室注射所致老年痴呆动物模型，观察了971对其学习记忆功 能障碍的改善作用。结果发现，ABl．40脑内注射可明显损伤小鼠学习记忆功能， 而971可明显缩短障碍小鼠的逃避潜伏期及游泳路程、增加障碍小鼠穿越原平台 的次数、减少第一次到达原平台的时间，表明971可明显改善ABl_40脑内注射所 致AD动物学习记忆功能。 2．971对AB引起神经细胞损伤的保护作用 采用MTT法观察了971对A仁25-35、A13140引起原代皮层神经细胞及神经母 细胞瘤sH—SY5Y损伤的影响，结果发现AD2s4s、Apl_40均可使神经细胞MTT还 原能力明显降低、细胞数目减少、突起变短、部分细胞胞体变阐、悬浮细胞数明 显增多：而加入10、50、100 p,g／m]的971后，Ap引起神经细胞的损伤明显受到 抗老年痴呆海洋药物9／1抗AB神经毒性及作用机制的研究抑制，细胞数目变多、悬浮细胞数量减少，且随着药物剂量增加，这种改善作用 抗老年痴呆海洋药物9／1抗AB神经毒性及作用机制的研究 抑制，细胞数目变多、悬浮细胞数量减少，且随着药物剂量增加，这种改善作用 越明显，提示971可明显抑制AD的神经细胞毒性。同时，我们也观察了971对 不同老化程度的AB(即孵育不同时间)细胞毒性损伤的影响，结果表明不同老 化程度的AB对神经细胞均具有不同程度的损伤，随着Ai5老化程度的增加，其毒 性越强(老化12、24、48小时的ABl．柏使细胞存活率分别降至84．2％、73．5％、 68，7％)，但如果在老化过程中加入100 p．g／ml的971，AB的细胞毒性作用明显降 低，提示971抗AD神经毒性可能与抑制其纤丝形成有关。另外，本实验还观察 了971先孵育再加Ap损伤、971与Ap同时加入细胞、Ap先损伤再加971这三种 处理方式的神经细胞存活情况，从而确定971抗AB神经毒性的作用环节。结果 发现，在这三种处理方式中AD损伤细胞程度不同，但无论是哪一种处理方式， 971实验组细胞MTT还原能力均高于Ap模型组，表明971可多环节抑制AB神 经毒性。 3．971对AB引起神经细胞损伤保护的作用机制探讨 (1)在细胞水平上探讨971抗AB神经毒性的作用机制 首先是在细胞水平上探讨了971保护AD诱导神经细胞损伤的作用机制。结 果发现，30 btM Ap可明显诱导神经细胞凋亡(凋亡率为24．8％)，而加入50、100 p．g／ml的971后，SH-SY5Y细胞凋亡明显受到抑制。深入探讨971抗AB所致神 经细胞凋亡的作用机制发现，971可明显抑制Ap诱导的神经细胞内游离钙离子 浓度的升高、自由基的产生、细胞脂质过氧化产物含量的增加，线粒体膜电位的 降低以及凋亡促进蛋白P53和Caspase一3蛋白表达的升高，并促进凋亡抑制蛋白 Bcl一2表达的上调，提示97I拮抗A[5细胞毒性损伤是通过其抗氧化、抑制胞内游 离钙浓度的升高而增加凋亡抑制蛋白的表达、阻断下游凋亡促进蛋白的表达，从 而最终抑制细胞的凋亡。 (2)在分子水平上探讨971抗AB神经毒性的作用机制 ①971对AO纤丝形成及解聚的影响 采用荧光分光光度计及电镜，观察了971对AB纤丝聚集及解聚的影响。971 对Ap纤丝形成影响的结果表明，Ap在12--48小时内，随着孵育时问的延长，纤 丝形成明显增加，Th—T染色的荧光强度逐渐增强(12、24、48小时AB的Th．T 2 抗老年痴呆海洋药物971抗AB神经毒性及作用机制的研究染色荧光强度分别为：2l，l、31．7、39．1)。然而当有971存在