马流感病毒青海株相关特性研究及其基因组分析-预防兽医学专业毕业论文.docx

摘 摘 要 马流行性感冒(Equine influenza，E1)，是危害养马业和赛马业的一种十分重要的 接触性呼吸道传染病，主要表现咳嗽、喷嚏、发热、食欲减退，怀孕母马可发生流产症状。 EI的病原为正粘病毒科A型流感病毒属的马流感病毒(Equine Influenza Virus，EIV)，EIV 与同属的禽流感、人流感和猪流感病毒关系较为密切。EIV基因组全长约为13．6kb，包括 有8个基因片段，分别为聚合酶(PB2、PBl、PA)基因、血凝素(HA)基因、神经氨酸酶 (NA)基因、核蛋白(NP)基因、基质蛋白(M)基因和非结构蛋白(NS)基因，编码lO 种蛋白。过去，在我国曾发生过三次规模较大的马流感流行。1994年，从青海省暴发马流 感的病马中分离出一株EIV，命名为A／Equine／Oinghai／1／94。为了弄清流行于我国马群 中EIV的来源及遗传学背景，并为进一步研制有效疫苗提供科学依据．本研究着重进行了 EIv，青海株(A／Equine／Qinghai／1／94)相关特性研究及其基因组分析。 ／将EIV青海株在SPF鸡胚中连续传7～8代后，病毒的血凝滴度趋于稳定，可达到l： 5l争以上，电镜下观察具有典型的正粘病毒粒子形态，病毒粒子大多是球形，有囊膜，个 别为丝状，平均直径lOOim。血凝活性的温度敏感性试验结果表明．73℃以上作用10分钟 和7l℃以上作用30分钟，血凝活性丧失。对EIV青海株进行的实验动物感染试验证实， 经滴鼻和肺脏接种双重途径可在小鼠、大鼠、豚鼠和兔体内产生EIV HI抗体．仅在小鼠 产生可见的精神萎靡、发抖、呼吸困难等症状，没有观察到有死亡现象。剖检可见发病小 鼠肺脏充血、淤血、肿大，从其肺脏分离出有血凝活性的病毒，电镜观察为典型的正粘病 毒形态；在大鼠、豚鼠和兔来观察到明显的临床症状及病理学变化，也未分离出病毒：抗 体水平监测结果显示，在兔体内产生的EIV HI抗体水平明显要高于小鼠、大鼠和豚鼠的 抗体水平。 HA是EIV最重要的结构蛋白和免疫保护性抗原，其基因在基因组中变异频率也最高。 为了明确我国EIV之间的亲缘关系、EIV与禽流感病毒的关系及我国EIV在世界EIV中的 地位，本研究克隆了国内3株EIV HA基固，测序后，构建了我国EIV与一些禽源和马源 流感病毒HA基因进化树。通过}lA基因序列比较分析发现，我国A／Equine／0inghai／1／94 株和1992年香港分离出的2株EIV关系密切．核苷酸同源率可达95％．这3株病毒均属于 国际上典型的H3N8亚型EIV：而我国A／Equine／Jilin／1／89及A／Equine／HeJlong Jiang／1／89株与A／Equine／Qin曲ai／1／94株的同源率均为82．6％，通过进化树分析发现， 这2株病毒均来源于禽。 用10日龄SPF鸡胚繁殖青海株ElY，从接种该毒株的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组 RNA，根据genebank中已发表的相应核苷酸序列设计并合成针对各基因的特异性引物，通 过反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增8个基园片段的cDNA，扩增的PCR产物经胶回 收纯化后，克隆到pG酬．T—easy载体上，重组质粒经酶切鉴定后进行序列测定。序列测定 正确后．通过计算机软件对其进行分析，并与国内外参考毒株进行比较．结果发现，克隆 的A／Equine／Qinghai／1／94 HA基因1738bp，编码575个氨基酸(AA)；NA基因1450bp， 编码484个AA：NP基因1554bp，编码515个AA：M基因978bp，编码326个AA：NS基 因813bp，编码226个从：PB2、PBl和PA基因分别为233Ibp、2332bp、2224bp，编码 774、775、740个AA。通过构建各基因进化树及序列比较分析发现，ElY青海株的各基因 在核苷酸和氨基酸水平上与欧洲的EIV参考毒株关系最为密切．因此推断，我国 A／Equine／Qinghai／1／94毒株可能来源于欧洲。 根据}IA基因阅读框架和pcDNAS．0的酶切序列设计一对引物，上游引物舍有HindIII !Im●皇■●鼻—|——曼—喜—■量—置—量——目——■E—■置——●皇—皇—■■—曹■皇奠詈■置鼍—舅—曼●暑宣置量|■■量量■|皇■寞—鼍 !Im●皇■●鼻—|——曼—喜—■量—置—量——目——■E—■置——●皇—皇—■■—曹■皇奠詈■置鼍—舅—曼●暑宣置量|■■量量■|皇■寞—鼍东北农业大学农学博士学位论文 酶切位点和Kozak翻译起始序列，下游引物含有Bali酶切位点。通过PCR反应，从pGI瑚-HA 扩增出带有Kozak翻译超始序列和酶切位点的IIA基因，并将该基因与pcl)NA5．0经 HindIII、Bali