酶解多肽一级序列分析与反应过程建模及结构变化初探-化学工程专业毕业论文.docx

中文摘要蛋白质酶促水解反应是在酶的专一性催化作用下使蛋白质水解生成胨、肽等 中文摘要 蛋白质酶促水解反应是在酶的专一性催化作用下使蛋白质水解生成胨、肽等 低分子量产物的过程。由于蛋白质高级结构复杂、酶作用位点众多，使得酶解过 程具有产物多样性和反应复杂性等特点。本论文在课题组已有研究工作基础上， 利用色谱／质谱联用技术以及动态光散射检测方法等多种先进的分析测试手段， 从一级序列分析到动力学过程模拟以及高级结构解析等多层次，对蛋白质酶解过 程进行了较为详细的研究。具体内容如下： 酶解产物反相高效液相色谱(RP，HPLC)分析条件的确定：选取一级序列已知 的牛血清白蛋白(BSA)和断裂位点高度专一的胰蛋白酶(Trypsin)组成模式酶解体 系，确定了反相色谱的紫外检测波长为214nm，流动相为水一乙腈一三氟乙酸 (TFA)。通过研究流动相中水相一有机相的梯度条件、流动相中离子对试剂TFA 含量及流动相流速等因素对分离效果的影响，确定了针对此体系复杂产物分析的 适宜梯度洗脱条件，即流动相中TFA含量为0．08％，流动相流速为1．0mL／min。 酶解产物液质分析及产物多肽一级序列的确定：采用已确定的反相色谱分析 条件，利用RP—HPLC对BSA--trypsin体系酶解全过程中9个不同水解度下的酶 解产物进行了色谱分析，并应用液质联用(LC．ESI．MS／MS)技术对产物多肽序列 进行了解析。通过bioworks软件和人工检索比对的方法对所得质谱数掘进行解 析，最终确定出各水解度下不同酶解产物所含的33个多肽的一级序列。 酶解多肽色谱保留行为预测模型的建立：运用最小二乘与岭回归两种算法， 建立了BSA-Trypsin体系产物多肽的反相色谱保留时间预测模型，经相关分析与 残差检验证明：对于酶解多肽，岭回归算法因消除了数据的多重共线性影响，而 使所建模型较最小二乘法拟合效果更佳；且对于不同多肽体系，各种模型之矧的 通用性不强，本文所建模型尤其适于酶解所得多肽的保留时间预测。 水解度值预测模型的建立：酶解过程中，水解条件(如底物浓度S、酶浓度 E、酶解温度T、酶解pH值以及酶解时间t等)直接影响水解度(DH)值的大 小，故其反应机理非常复杂。本文引入神经网络模型的概念，以S、E、T、pH 和t作为输入，以DH作为输出，建立了一个由输入层(5个神经元)、两层隐含 层(分别含4个神经元和5个神经元)和输出层(5个神经元)构成的神经网络模型。 利用大量酶解条件一水解度值数据对模型进行训练和验证，最终建立了较理想的 预测反应过程中水解度值的黑箱模型。 多肽酶解释放动力学模型的建立：根据不同水解度时酶解产物的质谱总离子 流图中各多肽对应的谱峰面积，计算各酶解多肽在水解产物中的相对含量。将多 流图中各多肽对应的谱峰面积，计算各酶解多肽在水解产物中的相对含量。将多 肽释放过程分为生成阶段和消耗阶段，并选取两类合适的方程形式对酶解过程各 多肽含量的变化进行拟合，建立了各个多肽的酶解释放动力学方程。经初步分析， 得到方程中部分参数的物理意义，为活性多肽的准确、高效制备提供了理论依掘。 酶解过程蛋白质高级结构变化初探：以酪蛋白一胰蛋白酶为例，采用动态光 散射技术，以磷酸盐为缓冲液研究了温度、离子强度和酶解行为对酪蛋白粒子平 均流体力学半径(冠)的影响规律。结果表明：尼值在升温过程中发生不可逆减小： 随离子强度增大， 届值先减小再增大；酪蛋白在胰蛋白酶作用下，溶液光散射 强度即分子量大小先急剧下降再逐渐趋于平缓，而届值的变化规律与之相反，并 推测了酪蛋白胶体酶解过程的结构变化模型即由原始致密的球状体逐渐舒展为 松散而规则的毛束状蛋白肽链。 关键词：蛋白质，多肽序列，HPLC．ESI．MS／MS，酶解，神经网络，岭回归 动力学模型 ABSTRACTEnzymatic ABSTRACT Enzymatic hydrolysis of protein is a kind of biochemical process to produce small molecular products such as peptones and peptides．This process has the characters such as variety of products and complexity of the reaction．In this thesis， the process of protein enzymatic hydrolysis has been researched in detail by using HPLC—ESI-MS／MS and the Dynamic Light ScaRering． Determination of the HPLC