马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

摘要马传染性贫血病毒(equine 摘要 马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)属反转录病毒科馒病毒属，是马 传染性贫血(EIA．简称马传贫)的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为It世界 上唯一投入麻用的慢病毒疫苗。该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫 预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的 调控作用，影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白，由于 其基冈的高度变异性，受到病毒学研究的普遍关注，通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其 亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析，发现二者的LTR和v基冈(尤其是gp90 编码区)筹异较大。 为了研究env基囡gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用．我们以EIAV强毒辽‘j啉(L株) 接种健康马，从不同时期发热期马血清中以RT_PcR扩增包含完整s2基醐qgp90基因片段；同时 以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段，将所得的强弱毒共30个env基冈 gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现，强弱毒gpgO序列存在着多个位点高 度的一致性变异．所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异．这些变异包括氨基酸的点突 变和插入或缺失，其中，氨基酸在极性与非极性之间的变换及氮基酸的插入和缺失造成糖基化数 量非常一致的变化。在对其它慢病毒(如H1V、SIV)研究过程中发现，糖基化对病毒的细胞嗜 性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较历发现． gp90基囡V3到v5V在强毒和弱毒之间差异显著，而在各自内部相对保守，变异较小。对27个s2 基冈进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现，s2基因中也存在着3个1}常一致的 点突变，没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV—DLA gnv基因变异研究的基础上，我们将马传贫强、弱毒 gp90全长及部分(V3-V5区)分别连接到逆转录病毒载体pBABE—puro，通过转染将马传贫强、 弱毒∞y基阿整合到包装细胞系PA317中，利用抗性筛选到稳定表达细胞系；然后将马传贫强、弱 毒gp90全妖及V3-v5N分别连接到高散真核表达载怫．pcDNA3．1(+)，转染293T细胞系并经抗性筛 选及弧克隆后获得高敛稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-vsN基冈的细胞系，为研究gp90及v3．V5 f露结构与功能打F了良好的基础。然而，我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为 主的慢病毒研究表明LTR和∞P基因中N·连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中平¨作川密切 相芙。我国马传染性贫血病毒强弱毒∞湛因之间N一连接糖基化存在明显的区别；根据强弱毒∞r 基冈变异的分析结果，构建了一系列N一连接糖基化突变分子克隆，力图对N．连接糖基化在我国屿 传染性贫血病毒致弱过程中的作H|进行阐述，通过转染驴白细胞并盲传104-℃,Jf亓仍朱获得N．迎接糖 基化突变病毒，我廿J推测可能的原冈是由rN．连接糖基化的突变均忙丁。月堪冈的v3一v5区，影响 J，在驴自细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制平}博}录过群中的作JL}』，升进一步研究EIAV的致病午¨免瞳机 制，我J在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆雨J EIAV-L株前病毒DNA全基冈细分子克隆的基 础上，川EIAV-L株的LTR利gp90编码区分：iif替换E／AV-DLA株感染性分f兜隆的1fH庸片段， 薨=以EIAV-L株的LTR和gp90编码区同时替换EIAV-DLA株感染性分子克隆的相虑片段，构建 薨=以EIAV-L株的LTR和gp90编码区同时替换EIAV-DLA株感染性分子克隆的相虑片段，构建 了三个E1AV-DLA株和L株前病毒基因组嵌合分子克隆，分州命名为pOK．LTR·DLA／L、 pOK．env—D乙A，L、poK．LTRenv-DLA／L。通过转染及盲传获得了一株嵌台病毒pOK-LTR-DLA／L。 替换了LTR的强弱毒嵌合病毒可以在驴白细胞中有效复制并且产生细胞病变。随后我们进行了马 体试验，通过对EIAV结构蛋白特异性抗体的监测表明，嵌合病毒可以有效刺激机体产生针对农 壳蛋白CA(p26)和跨膜蛋白gp45的特异性抗体．但不能有效刺激机体产生针对附加蛋白p9和 核农壳蛋白NC(p11)的特异性抗体．而对照攻毒马在笈病至死亡期间均检测到了高水平的附加 蛋白p9和核农壳蛋白NC(p11)的特异性抗体，结果表明，嵌合病毒在马体内是以低水平的复 制长期刺激机体产生免疫应答，从而获得