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测定转氨酶活力的实验报告 　　实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定　　【目的和要求】　　了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。　　【原理】　　生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活力最强。它们催化的反应如下。　　正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。　　测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二　　硝基苯腙。　　丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。　　【操作方法】　　1．标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按　　2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲(来自:写论文网:测定转氨酶活力的实验报告)线时，须加入一定量的底物，以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。　　先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。　　2．酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。。计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。　　【试剂和器材】　　一`试剂　　1．试管及试管架2．吸管　　3．恒温水浴　　4．分光光度计　　二`器材　　1．/L磷酸缓冲液2．μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。　　取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内[当日配制]。3．谷丙转氨酶底物。　　取分析纯α-酮戊二酸DL-丙氨酸克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。　　4．2，4-二硝基苯肼溶液。　　在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼，加100ml1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置[冰箱内保存]。　　5．/L氢氧化钠溶液。6．人血清[冰箱内保存]　　实验二转氨酶活性的测定　　一．研究背景及目的　　转氨酶是生物体内重要的一类酶。转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用[1]。转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。其中以谷丙转氨酶和谷草转氨酶最为重要。GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。由于都有丙酮酸的生成，所以可以通过实验测定一定时间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。　　二．原理　　由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃，条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。丙酮酸含量的测定运用的是比色法。丙酮酸可与2,4-二硝基苯