棉花枯萎病菌拮抗菌的筛选和抑菌机理初探-微生物学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘 要 目的：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中筛选出拮抗棉花枯萎病菌的内生菌，初步分离拮 抗菌 A 的抑菌物质，探究抑菌机理，并研究拮抗菌对棉花生长的影响。 方法：拮抗菌的分离和筛选采用平板培养法，生长曲线、最适 pH、糖发酵、淀粉水解试验及革 兰氏染色对拮抗菌的基本性质进行了研究；通过 16SrDNA 序列比对建立系统进化树。超声波破碎细 胞，离心分离胞内、胞外分泌物，硫酸铵沉淀透析法分离胞内抑菌粗蛋白，考马斯亮蓝 G-250 法检 测蛋白浓度，Sephadex G-75 柱层析初步纯化抑菌蛋白，SDS法测定抑菌蛋白分子量大小。抑 菌物质对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生孢子萌发的影响分别采用平板培养法、显微计 数法、凹玻片培养法。检测了拮抗菌 A 处理棉花种子后，其萌发率和成株率的变化，以及棉苗在不 同生长时期的 POD、PPO、PAL 活性。 结果：1、本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了 4 株对棉花枯萎病菌具有拮 抗性的内生菌，其中拮抗菌 A 抑菌效果最好，初筛抑菌圈直径达 26.96mm。经过鉴定，拮抗菌 A、 B、C、D 分别属于 Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus tequilensis、Bacillus sp.、Klebsiella pneumoniae。 2、拮抗菌 A 的胞内分泌物对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生分生孢子萌发的抑制 率均大于胞外分泌物。其中对棉花枯萎病菌产分生孢子的抑制效果最好，平均抑制率为 40.14%，对 数生长期的拮抗菌对产分生孢子的抑制率最大，为 88.81%。 3、浓度为 80%的硫酸铵沉淀出的蛋白对棉花枯萎病菌的抑制率最大(19.55%)。分离的粗蛋白保 持抑菌活性的最高耐受温度为 60℃，最高耐受 pH 为 8，最低耐受 pH 为 4。 4、抑菌粗蛋白经过 Sephadex G-75 柱层析分离，在 200-400s 之间收集的洗脱液对棉花枯萎病菌 产分生孢子的抑制率达 34.79%，均大于其对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率。初步分离得到的抑 菌蛋白分子量在 25 kDa-100 kDa 之间。 5、拮抗菌 A 处理棉花种子后可提高其成株率。棉花苗期不同生长时期的 POD、PPO、PAL 酶 活性测定结果表明，接种棉花枯萎病菌后，用拮抗菌 A 处理过的棉花植株在播种 40d 后 PAL 酶活性 显著增加；此外，同一生长时期、不同处理的棉苗 3 种酶活性均无显著差异。 结论：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了 4 株对棉花枯萎病菌抑制作用 较好的内生菌，初步探究了拮抗菌 A 的抑菌机理；拮抗菌 A 抑菌物质产生于对数生长期，胞内分泌 物抑菌效果较好，主要抑制途径为抑制棉花枯萎病菌产分生孢子；抑菌粗蛋白对温度和 pH 的稳定 性均可以满足生产实践的需要；初步纯化的抑菌蛋白的分子量在 25 kDa -100 kDa 之间，且仍保持一 定的抑菌活性；拮抗菌 A 处理棉花种子后可提高其成株率，但棉花幼苗的活性氧酶系统无明显增强。 关键词：棉花枯萎病，拮抗菌，胞内分泌物，胞外分泌物，抑菌蛋白 I 万方数据 万方数据 Abstract Objective: This study isolated and screened endophytic bacteria inhibited on Fusarium Wilt of cottons(Fusarium oxysporium)from Glycyrrhiza uralensis, Sophora alopecuroides and Resina Ferulae. Separated the antibacterial substance of antagonistic bacteria A preliminarily, explored the antibacterial mechanism, and observed its effect on cottons. Methods: The isolation and screening of antagonistic bacteria by plate culture method. The basic properties of antagonistic bacteria including growth curve, the optimum pH, sugar fermentation, starch hydrolysis test and Gram staining; ide