马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达 马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达 及其抗血清的制备 摘要 本研究的目的是构建马铃薯s病毒外壳蛋白基因的原核表达载体，使其在大肠杆 菌中高效表达，用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清，为进一步制备马铃薯s病毒 的ELISA检测试剂盒打基础。 用PVS—cp基因的上、下游引物及pGEM—pvs模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳 显示扩增产物为一条分子量约为890 bp的特异条带。用U1 trafree—DA试剂盒一步离 心法回收890 bp的特异扩增片段。然后与T表达载体pBAD／Thio连接，重组质粒转 化受体菌TOPIO。经氨苄青霉素抗性筛选、质粒电泳检测、PCR扩增及SphI与Pstl 限制性内切酶的单酶切和双酶切鉴定，筛选到了阳性克隆，相应的重组质粒被命名为 pBAD—pvs。单独使用基因的引物或混合使用基因及载体的引物进行PCR检测，获得了 目的基因正向插入表达载体的目的克隆，对应的重组质粒命名为pBAD—pvs+。 重组质粒pBAD-pvs+中外源基因是受阿拉伯糖启动子控制表达的。在42。C，TOPl0 (pBAD-pvs+)用2％阿拉伯糖诱导培养4小时后，SDS—PAGE凝胶电泳显示表达产物 中有一条分子量为46 KDa的特异性蛋白条带，其大小与预期的融合蛋白相符，该蛋 白在总蛋白中的含量为20．22％。在硝酸纤维素膜上进行Western b