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血清γ球蛋白的提纯实验报告 　　血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定　　一、实验目的　　1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；　　2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；　　3.了解柱层析技术。　　二、实验原理　　血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。　　本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。　　1．盐析　　蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。　　2．脱盐　　盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，　　常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。　　3.纯化　　离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。　　本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。　　脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。　　4.纯度鉴定　　血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于。它们在的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白　　流动相：醋酸盐缓冲液。　　浓缩：　　高分子性质：SephadexG-25吸水　　4、电泳分析蛋白质　　血清中各种蛋白质都有其特有的等电点，利用pI与pH的关系，pHpI，待分离物质带负电，电泳时向正极移动；pH，待分离物质带正电，电泳时向负极移动；pH=pI，待分离物质不带电，电泳时不向正极或者负极移动。在同一条件下，不同蛋白质带电荷有差异，分子量大小也不同，所以泳动速度不同。血清中蛋白质等电点均低于7，在pH=的缓冲溶液中，都形成负离子向正极移动，血清蛋白质可分成五条区带。　　【实验结果】　　经过电泳分析，与对照组做对比可以明显观察到血清蛋白的五条带　　左侧为全血清对照，右侧为我们组提取的蛋白质电泳结果。　　【实验分析】　　优点　　1提取的γ蛋白较为成功，纯度较高，基本没有肉眼可见到的其他带的蛋白。　　2.在进行层析操作时，严格进行转圈滴加，使得液面保持一个水平状态，保证液体留下时经过相同的距离。　　3.硫酸铵在进行滴加时，严格按照边摇边逐滴加入。　　4.层析柱的上液层未干涸，保证时刻有液体。　　5.离子交换柱使用完后先用醋酸盐缓冲液洗两个柱长，再用DEAE再生液洗两个柱长，最后再用醋酸盐缓冲液平衡两个柱长。方便后边的同学使用。　　6.凝胶柱使用完毕后用洗脱液流洗3～4个柱长，保持上层有2cm以上的液体，关闭下方控制夹。方便后边的同学使用。　　7.G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高约，离心后，管内凝胶倒入烧杯回收。　　8.洗脱液收集无需分步，用载玻片检测蛋白，约每5滴检测一次，从开始出现白色悬浊液时开始收集，直至刚好不在出现白色悬浊液沉淀为止，所收集到的即为试验所需的蛋白质，本次试验不用纳氏试剂。　　9.滴加试剂等操作准确规范。　　不足　　1.实验过程中险些