血清谷丙转氨酶的测定实验报告.docxVIP

血清谷丙转氨酶的测定实验报告 　　实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定　　【目的和要求】　　了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。　　【原理】　　生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活力最强。它们催化的反应如下。　　正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。　　测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。　　丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。　　【操作方法】　　2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。　　先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。　　2．酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。。计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。　　【试剂和器材】　　一`试剂　　1．试管及试管架2．吸管3．恒温水浴4．分光光度计　　二`器材　　1．/L磷酸缓冲液2．μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。　　取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内[当日配制]。3．谷丙转氨酶底物。　　取分析纯α-酮戊二酸DL-丙氨酸克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。　　4．2，4-二硝基苯肼溶液。　　在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼，加100ml1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置[冰箱内保存]。　　5．/L氢氧化钠溶液。6．人血清[冰箱内保存]　　实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定　　【目的和要求】　　了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。　　【原理】　　生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活力最强。它们催化的反应如下。　　正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。　　测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二　　硝基苯腙。　　丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。　　【操作方法】　　1．标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按　　2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。　　先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作