灭活原生质体融合法在蛹虫草优良菌株选育中的应用-微生物学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 齐 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 07 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：‘阈曦炙 时间：彬年乡月“、日 学位论文使用授权书 糊黼张鼠终炙钟始@拓孬 签名日期：矽占年多月／5． 签名日期：跏6年6月I岁日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之闻 灭活腺生质体融合法仃蛹虫草优良菌株选育中的应用摘要 灭活腺生质体融合法仃蛹虫草优良菌株选育中的应用 摘要 蛹虫草(Cordyceps militaris(L．Fr)Link．)属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲 (Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属 (Cordyceps仔t)Link)真菌，可滋补强身、补肺益肾、止咳化痰，是我国传统的 名贵中药材，具有很高的经济价值。 本研究从全国收集了9个蛹虫草菌株，编号为1-9号，通过人工培养观察其农 艺性状，采用高效液相法(HPLC)测定菌丝体胞内虫草素、腺苷和尿苷含量，3，5． 二硝基水杨酸法(DNS)测定糖含量。研究结果显示，4号菌株原基分化早且数量 多，较适合武汉地区春季栽培，8号菌株表现最优，予实体粗壮且生长整齐，虫草 素及胞内塘含量显著高于其它菌株。选定4号菌株和8号菌株作为灭活原生质体融 合的亲本，以便筛选得到原基分化早、子实体粗壮且虫草素含量高的优良子代。 原生质体再生试验和最低致死时间试验表明，酶解5小时再生率最高，紫外灭 活和60℃热处理的最低致死时间分别为8min和14min。聚乙二醇(PEO)作为融合 剂，将灭活的双亲原生质体等量混合，融合子因为灭活位点互补可以再生，未融合 的亲本则不能再生。 用双层培养法25‘C培养4天，随机挑取再生菌株228个。228个再生菌株菌丝 体液体培养20天后，酯酶同工酶电泳筛选具有双亲特异酶带的再生菌株53个，初 步判断为融合子。HPLC法测定53个再生菌株胞内虫草素等核苷物质含量，有36 株再生菌株含量与8号亲本相近或高于8号亲本．采用ISSR引物进行PCR扩增， 53个再生菌株中有26个菌株同时具有双亲特有带，进一步从分子水平表明这26个 再生菌株为融合子． 对36个再生菌株人工培养，其中17个菌株长出幼嫩子实体，但原基数量远低 于双亲。综合虫草素含量和人工培养结果，选出16株进行遗传稳定性的测定。16 个再生菌株转管培养4次，测定菌丝体胞内虫草素含量，比较各株每代虫草素含量 差异，考察其遗传稳定性。结果表明，16株中除2株虫草素含量有下降趋势外，其 余14株含量稳定，其中明显高产的融合子有59、6l、69、136和186等共5株，其 各代菌丝体虫草素平均含量分别为8号亲本的1．32、1．17、1．49、1．73、1．33倍。 本研究表明，灭活原生质体融合用于蛹虫草育种中．能得到真正的融合子，其 遗传性状基本稳定，目前尚未检出农艺性状超过双亲的融合子，但主要活性物质虫 草素含量普遍提高。虫草素高产融合子在经过进一步遗传稳定测试后，可用于以获 得虫草素为目的的菌丝体发酵培养中。 关键词：原基分化；虫草素；灭活原生质体；原生质体融合；遗传稳定性 3 华中农业大学2006届硕十学位论文Abstract 华中农业大学2006届硕十学位论文 Abstract Cordyceps militar括rL．Fr)Link．is a type of famous traditional Chinese medicine winl hi曲economic value，which belongs to Ascomycota,Pyrenomycete,Sphaeriales, Clavicipitaceae and Cordyceps group． Nine strains of C militar括were collected from all over the country and numbered 1．9．Agriculture properties of nine strains were observed by bottle cultivation indoors． And cordycepin,adenosine．ureter and sugar conte