棉花农杆菌介导的转基因体系建立-作物专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是受棉花纤维/绒毛突变体候选基因的克隆与功能验 证（省钱江人才计划）项目资助，在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自 己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人 发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的 材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有 严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密, 本学位论文属于不保密。 □ （请在方框内打“√”） 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导教师亲笔签名： 日 期： 摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘要 根癌农杆菌介导法是棉花遗传转化的最常用方法。陆地棉常用的受体有下胚轴、 子叶、茎尖和棉花的胚性愈伤组织等。以下胚轴为受体的农杆菌介导法是最成熟的转 化体系，但是转化周期较长，至少 10-12 个月；农杆菌介导法转化棉花胚性愈伤组织， 不但可以缩短转化周期，而且能够降低工作量，最终提高转化效率，但是获得的转基 因苗会出现高频的变异；以茎尖作为受体的转化体系属于器官发生的再生过程，会出 现嵌合体现象。本研究首先选取新陆早 45 号的下胚轴作为外植体，经过愈伤组织诱 导、胚性愈伤组织培养、胚状体形成和小植株的获得等实验，成功建立了棉花再生体 系；在此基础上选取新陆早 33 号的胚性愈伤组织为受体，将 SM 基因进行遗传转化， 经过抗性筛选和胚胎发生，获得转基因小苗，于温室嫁接成活；同时，尝试选成熟胚 作为受体，进行转化，经过约 20-30d 的抗性筛选，获得了转基因小苗，是一种不依 赖于组织培养的一种转化方法。具体的研究结果如下： 1、以传统再生体系为基础，选取新陆早 45 号下胚轴作为外植体进行组织培养， 建立了高效的再生体系。（1） MS+0. 1 mg.L-12,4-D+ 0.1 mg.L-1 KT+1.9 g.L-1 KNO3+ 0.75 g.L-1 MgCl2+ 30 g.L-1 葡萄糖+ 2.0 g.L- 1 Gelrite 是适合愈伤组织增值培养基，利用 该培养基，愈伤组织的诱导率为 88.5%。（2）待愈伤组织增殖到 5-7mm 时，进行胚 性愈伤组织诱导，约 2-3 次继代会出现胚性愈伤组织，观察发现颜色为浅绿、灰绿到 黄绿，质地疏松的愈伤组织容易分化出胚性愈伤组织，分化率为 73%。（3）挑出单个 胚性愈伤组织进行胚状体诱导，进一步再生小苗，最终得到了 16 株再生小苗。整个 周期约 5-7 个月。 2、在建立上述棉花高效再生体系的基础上，通过农杆菌介导法将棉花的 SM 基 因转化到新陆早 33 号的胚性愈伤组织中，经过抗性筛选、分化培养和胚胎发生等阶 段，获得了 10 棵转基因小苗。整个转化周期 5-7 个月，提取这些转基因小苗的 DNA， PCR 检测 SM 基因的阳性率是 77%。 3、在以成熟胚为受体的再生与转化实验中，首先从筛选出最合适的品种出发， 选用四个陆地棉的种进行试验，结果发现四个品种的瞬时表达率没有差异，但新陆早 45 号的转化率比其他三个品种高出 10-20%。同时对农杆菌菌液的浓度，侵染时间， 卡那霉素筛选浓度，AS 和以及表面活性剂有无等条件进行了实验。实验表明，OD I 值在 0.6，侵染时间为 15min，卡那霉素筛选浓度为 100mg/L，侵染时加入 AS 和 Silwet-77，转化效率最高，高达 25%。最终得到转基因植株 28 棵。转化周期为 1 个 月左右，阳性率为 32%。 本研究建立了以胚性愈伤组织和成熟胚为受体，农杆菌介导转化的产生转基因棉 花的方法，经分子验证（GUS 染色、PCR）和点涂卡那霉素，成功将 SM 基因导入了 新陆早 33 号和陆地棉 WC，为棉花转基因研究提供一种新的方法。 关键词：陆地棉；再生体系；胚性愈伤组织；成熟胚；农杆菌介导转化法 II AB ABSTRACT Abstract The preferred method of cotton genetic transformation is mediated by agrobacterium. The common receptors used in cotton genetic transformation are hypocotyl, cotyle