绿黄隆残留免疫分析化学研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

—～．堡重垒!堡堕堕壁堕丝蕉坌堑些堂堡塞 —～．堡重垒!堡堕堕壁堕丝蕉坌堑些堂堡塞 ! 绿黄隆残留免疫分析化学研究 摘要 绿黄隆是超高效磺酰脲类除草剂，农田土壤中绿黄隆残留量0．5叫g就可能对 敏感作物造成药害。 本文在已获绿黄隆抗体基础上，首次制备了对绿黄隆具特异性的高容量免疫 亲和色谱柱(IAC)，考察了免疫吸附剂的性能，对IAc条件进行了优化，选择口H7．2 磷酸缓冲液作为吸附与平衡介质，80％甲醇作为最佳洗脱液。在优化条件下，IAC 柱的动态柱容量最高可达3．5 g绿黄隆加l gel。当样本溶液中绿黄隆含量2ng／m1 时。经IAC柱吸附分离后。富集效率250倍。经IAC柱净化后的空白土壤提取液 (二氯甲烷提取路线)作绿黄隆标样的稀释介质，用包被抗体(酶标半抗原，E-H) 直接竞争ELISA法检测，所得工作曲线与标准曲线(用pH7．2 PB作绿黄隆标样的 稀释介质)基本一致。其I％为10．14ng／ml，Ic勰为0．4143ng／ml。在空白土壤样 本中添加O．1 g／g绿黄隆，提取液经IAC柱净化浓缩后，用E-H直接竞争ELISA 法检测，三次重复的平均回收率为94．09％，变异系数为lO．11％。 建立了包被抗体(酶标半抗原，E—H)直接竞争ELISA法。在优化条件下(最 佳抗原抗体稀释倍数、pH、离子强度、竞争反应时间等)，以未经IAc柱的空白土 壤提取液(碳酸盐缓冲液提取路线)作绿黄隆标样的稀释介质，E-H直接竞争ELISA 法检测，所得工作曲线与标准曲线有一定差异。其IC*为O．1095 g／ml，IC”为1．53 ×100u g／ml。在使用绿黄隆进行麦田除草的不同地区、不同使用年限的农田中分 别取土样，分离提取(碳酸盐缓冲波提取路线)土壤中的绿黄隆残留，pH直接竞 争ELISA法检测。结果表明：绿黄隆连续使用5年、3年和使用1年的田块其绿黄 隆平均残留量分别为0．35 ng／g、0．295 ng／g、0．234 ng／g，随使用年份的增加略有 累积。平行条件下，在空白土壤中添加0．1．1 g／g绿黄隆，E_H直接竞争ELISA法 测得平均回收率为84．69％。土壤中绿黄隆残留ELISA法的检测结果采用生物测定 方法加以验证，两者测定结果基本一致。 偏振荧光免疫分析法(PFIA)是基于荧光素标记的半抗原与相应抗体结合后 免疫复合物偏振荧光的变化为基础的均相竞争免疫分析方法。本文首先建立了示 踪剂(荧光标记半抗原)和抗体的稀释曲线，选择示踪剂的最佳工作浓度为6× 10一mol／L，抗体的最佳工作浓度为2×lO-Tmol／L，在此基础上，将不同浓度的绿黄 隆标样溶液、抗体溶液与示踪剂溶液三者混合反应，测定偏振荧光的变化。建立 扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 绿黄隆偏振荧光免疫分析标准曲线， 并进行回归分析。所得回归方程为 I=70．87+1 9．40LogC，ICs020．08397 g／mL， IC2。-2．39×10_3 g／mL。 关键词；绿黄隆残留，酶联免疫吸附分析 (ELISA)，免疫亲和色谱(IAC)， 偏振荧光免疫分析(PFIA) Studies on Immunochemistry for Residue Analysis of Chlorsulfuron Abstract Chlorsulfuron is sulphonylurea herbidde．n is effective in controlling variety of weeds common cereal grain．The sensitive crops could be damaged when the chlorsulfuron residue in soil is higher thall O．5ng／g． With the developed polyclonal anti．chlorsulfuron antibodies．the imrrlunoa伍nity chromatography(IAC) for chlorsulfuron was established． Anti—chlorsulfuron immunosorbent was prepared by coupling purified antibodies(IgG)to CDI—activated Sepharose 4B．The optimized conditions of IAC were pH7．2 phosphate buffer(PB)as equilibrium medium．and 80％methanol eluent．The dynamic column capaeity was 3．5 ch