慢病毒介导血友病B基因在离体细胞中的表达-内科学(血液病)专业毕业论文.docxVIP

Ir Ir 1011803 榆州医学院硕士学位论文 简字表 A_PTT activated part thromboplastin time 活化部分凝血活酶时间 cFIX canine coagulation factor IX 狗凝血因子Ⅸ DMSO dimeth)7lsulfoxide 二甲基亚枫 GFP enhanced green fluorescent protein 增强型绿色荧光蛋白 FBS fetal bovine serLl．m 胎牛血清 HIV．1 human immunodeficiency virus一1 人类免疫缺陷病毒．1 MSCs mesenchymal stem cells 骨髓基质细胞 MOI mulfiplic蚵of irffecfiort 感染复数 PUB ubiquinone promoter 泛醌启动子 VSV．G vesicular stomatitis virus—glycoprotein水疱性口炎病毒G糖蛋白 徐州医学院硕士学位论文慢病毒介导血友病B基因在离体细胞中的表达 徐州医学院硕士学位论文 慢病毒介导血友病B基因在离体细胞中的表达 中文摘要 目的： 构建泛醌启动子(PUB)驱动的携带狗凝血因子IX(cFIX)基因的慢病毒三 质粒表达载体，体外转染骨髓基质细胞(MSCs)和人胚肾细胞(293T)，观察转 染后是否能获得有效的cFIX表达，为临床基因治疗血友病B提供实验依据。 方法： 采用限制性内切酶酶切载体PTK68’，获得cFIX基因片断，并连接至慢病毒载 体PTKl51(含PUB启动子)，重组质粒命名为PTKl64。采用改良的磷酸钙沉淀法 将包装质粒△NRf、包膜蛋白质粒VSV-G和构建的重组转移质粒PTKl64共转染 293T包装细胞，72小时后收集病毒上清并过滤，以MOI 3：1比例感染第三代MSCs 和293T细胞，24小时重复感染一次，48小时后用FIX促凝活性一期法测定细胞 上清中cFIX活性。 结果： 成功构建含cFIX基因的慢病毒载体转移质粒PTKl64。PTKl64与△NRF、 VSV-G构成三质粒慢病毒载体，同时以携带绿色荧光蛋白GFP的载体PTKl53为 对照，共转染293T包装细胞72小时后可在荧光显微镜下观察到对照组GFP表达 率约为70％，病毒滴度约5x106IU／ml。以培养第三代的MSCs(CD90表达阳性率 为94．31％)和293T细胞作为靶细胞，过滤后的病毒上清感染靶细胞，48小时后 培养细胞上清可检测到cFIX活性，两种靶细胞分别为(26．33士2．08)％和 (19．7土1．53)％，且MSCs表达cFIX明显高于293T细胞(pD．05)。 结论： 1．成功构建PUB启动子驱动的cFIX基因的三质粒慢病毒表达载体，包装后 徐州医学院硕士学位论文获得较高的病毒滴度。 徐州医学院硕士学位论文 获得较高的病毒滴度。 2．采用密度梯度离一Ii,结合贴壁筛选法分离培养骨髓可获得高纯度的MSCs。 3．包装好的携带cFIX的慢病毒可成功感染MSCs和293T细胞，FIX促凝活 性一期法均可检测到eFIX活性，且MSCs表达高于293T细胞。 关键词慢病毒血友病B骨髓基质细胞基因治疗 徐州医学院硕士学位论文The 徐州医学院硕士学位论文 The Expression of Hemophilia B Gene in vitro Mediated by Lentivirus A-BS‘I’}tAC‘l’ Objective We contructed three plasmids lentiviral vector containing canine coagulation factor IX(cFIX)gene with ubiquinone promoter(PUB)．The mesenchymal stem cells and 293T cells were inefected by lentivirirus in vitro，and observed the expression of cFIX gene，which provided experimental evidence for gene therapy of clinical hemophilia B．Methods We obtained cFIX gene part by digesting lentiviral vector PTK68’、Ⅳith restriction endonuclease and connected it to 1entiviral vector PTKl 5 1 fwith PUB promoter)with T4DNA ligase．Th