胚胎干细胞的培养.docVIP

胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。MEF 和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子。MEF和STO培养上清中抑制胚胎干细胞自主分化因子--白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor；LIF）含量在500～1000IU/ml（分泌型）,同时在MEF和STO基质上还存在LIF（基质型）。无饲养层培养法则是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或在基础培养基中加入重组的LIF制备成条件培养基。如果使用这样的条件培养基培养小鼠胚胎干细胞，可以不使用饲养层细胞，能保证小鼠胚胎干细胞增殖的同时维持未分化二倍体状态。二、胚胎干细胞的分离与培养(一)饲养细胞的培养饲养细胞是指与胚胎干细胞共培养时能促进其增殖和抑制其自主分化的细胞。1、主要实验材料（1）细胞 可作为饲养层的细胞有二类: 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐 硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞。（2）培养液 DMEM(葡萄糖1.0g/L), 添加10%小牛血清(NBS)、 青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml。（3）消化液 0.25% 胰蛋白酶以1:1比例加入0.02% EDTA。（4）小鼠 周龄为7～8wk的性成熟母小鼠和周龄为8wk的种公鼠。2. 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养（1）小鼠胚胎的准备1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。2)每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。3)取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PBS或无血清DMEM平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。（2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养培养方法有两种: 组织块培养法和单细胞悬液培养法。组织块培养法：1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下 的碎块,吸置于离心管内。2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。3) 向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。4) 加入等体积的培养液终止消化。室