枯草芽孢杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶基因的克隆与功能研究-药理学专业毕业论文.docxVIP

中国医学科学院博士生毕业论文摘要 中国医学科学院博士生毕业论文 摘要 甲硫氨酸氨基肽酶负责切除新生肽链N端的起始甲硫氨酸，其编码 基因是细胞存活的必需基因。迄今为止报道的所有真核细胞都含有两个 该基因拷贝，而原核细胞只含有一个拷贝。本文以九八年刚完成全基因 组序列的革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为模式生物，应 用基因组信息学技术和相应软件进行序列同源搜索，发现枯草芽孢杆菌 基因组中可能含有两个编码甲硫氨酸氨基肽酶的候选基因，分别为map 和讲G。将这两个基因分别克隆到大肠杆菌中表达纯化，以三聚氨基酸 类似物为底物，对纯化蛋白进行酶活测定，结果显示只有Map有切除N 端甲硫氨酸的功能，而YflG在该试验条件下不具活性。在生化测定的同 时，我们又应用遗传学方法构建突变株分析基因功能。以大肠杆菌自身 map基因条件缺失突变株作为宿主细胞，分别引入诱导表达的枯草芽孢 杆菌的map和卵G基因，在不同诱导条件下比较菌株生长情况，结果显 示map和川G两个基因都可拯救大肠杆菌因缺失自身map基因产物而导 致的致死效应。在此基础上本文又成功地在枯草芽孢杆菌体内证实了map 和妒G基因在该细菌内都有活性，并且其功能可以互相替代，只有二者 同时缺失才会使细胞死亡。除了对这两个基因的功能鉴定，本文还阐明 了它们各自所在操纵子的遗传结构，并采用RT-PCR、Northem印迹及引 物延伸等多种方法，最终分别对它们的启动子进行了定位。结果显示map 基因位于一个长的总共含有24个基因的操纵子末端，其中21个基因编 码核糖体蛋白，该操纵子上游有两个串联的具有典型．10区和．35区的强 启动子。川G基因与其下游yflH基因构成一个操纵子，其启动子序列不 具备典型结构特征。此外，本文还对二者的转录调控，尤其是map基因 独特的与细胞生长时期相关的表达谱进行了研究。 中国医学科学院博士生毕业论文Abstract 中国医学科学院博士生毕业论文 Abstract Ribosome—mediated protein biosynthesis is always initiated with either methionine(in eukaryotes)or N-formylmethionine(in prokaryotes and eukaryotic organelles)．Methionine aminopeptidase(脚)is responsible for removing N—terminal methionine from nascent peptides and the gene is essential to the cell．Each eukaryotic cell possesses two map gene copies while prokaryotes have only one copy in each genome，according to the papers SO far．Bacillus subtilis，a Gram-positive bacterium whose whole genome sequence had just been finished in 1 998，was chosen as the model system in this study．Sequence homology searching hinted there were two candidate genes for MAP function in B．subtilis，map and川G respectively． Their proteins homology value is 65％．Both of these two genes were cloned into Escherichia coli for overexpression．Met-thioester-Phe，an analogue of tripeptide，as substrate，cobalt as cofactor,biochemical assay was tested, which showed that only M印is active while YflG has 110 enzymatic activity under this condition．E coli Pv—map mutant as host cell，map and yflG，whose expression was under the control of arabinose，were introduced in trans for genetic rescu