棉花GhNCED2基因的遗传转化及表达研究-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

Genetic Transformation and Expression Analysis of GhNCED2 Gene from cotton（Gossypuum hirsutum L.） A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Yu Juan （Crop Genetic Breeding） Dissertation Supervisor:Wei Yi Nong June,2012 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I 摘 要 目的：干旱、盐碱及低温等不良环境条件，严重影响植物的生长发育，甚至导致植物死亡。脱落酸 （abscisic acid, ABA）作为一种胁迫激素，在植物应对胁迫环境过程中发挥重要作用。干旱、高盐和 低温胁迫均能引起植物内源 ABA 水平的提高，生物化学和遗传学的证据表明由 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase, NCED）所催化的氧化裂解反应是高等植物 ABA 合成途径中的关键步骤。本文主要研究棉花 GhNCED2 基因的遗传转化及表达，为利用该基因提高 植物的抗逆性奠定理论基础。 方法： 本 研 究 利 用 从 棉 花 中 克 隆 到 的 一 个 逆 境 诱 导 基 因 -GhNCED2（Genebank序列登录号： HM145908），通过农杆菌介导法将GhNCED2基因转入陆地棉品种新陆早33、SR1烟草及BY-2烟草悬 浮细胞，对逆境下转基因植株中GhNCED2基因的表达和相关生理指标进行初步分析。 结果：1.根据已知的 GhNCED2 基因全长序列加上 BamHⅠ和 SacⅠ两个酶切位点设计特异引物获取 目的基因，构建了该基因的超表达载体 PZP35S-GhNCED2，经测序对比正确后转化农杆菌 EHA105 为后续工作做准备。 2.以新陆早 33 胚性愈伤为受体材料进行目的基因的遗传转化。经过组织培养结合卡那霉素（50 mg/L）抗性筛选，培养转化外植体至成苗，共获得 50 株再生植株，通过植物基因组 PCR、RT-PCR 和卡那霉素涂抹鉴定，其中 5 株为转基因植株。再生植株通过温室培养至现蕾、开花、结铃后发现： 再生棉株均为不育株且在其株型、叶型、铃形、果枝类型等农艺性状上都出现了不同程度的变异， 变异频率高达 100%。其原因可能是以胚性愈伤组织为受体材料的转化和组织培养过程中发生了体细 胞无性系变异。 3.通过叶盘转化法，将 GhNCED2 基因转入 SR1 烟草中，共获得 30 株再生植株；经鉴定其中 7 株为转基因烟草。通过温室培养收获转基因烟草 T1 代，再对其分别进行 2%NaCl、4℃、20%PEG 逆境胁迫处理，利用卡那霉素筛选、PCR 扩增和 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 分析表明： GhNCED2 基因已整合入烟草基因组中，并能在 T1 代中稳定表达。随着逆境胁迫时间的推移其表达 量变化规律基本一致呈先上升后下降的趋势，干旱、盐碱及低温胁迫均都能诱导 GhNCED2 基因的 大量表达，且该基因对干旱胁迫的响应更加积极，而对冷害更加迅速。结合高效液相色谱法（HPLC） 测定逆境下植物叶片中 ABA 含量的变化及叶绿素荧光参数分析表明：随着时间的推移 GhNCED2 基 因的表达量与 ABA 的积累量变化趋势基本一致呈先上升后下降的趋势，ABA 积累量达到峰值的时 间稍落后与该基因的表达；转和非转基因植株的 Fv/Fm、Fv/F0 的值都有所下降但转基因植株的下降 幅度低于野生型。 4. 采用农杆菌介导法将 GhNCED2 基因导入烟草悬浮细胞中。经过卡那霉素直接筛选、