棉花抗枯萎病相关基因的克隆-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

Cloning of Genes related to Fusarium disease in Cotton A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Zhang wei (Crop Genetics and Breeding) Dissertation Supervisor:Prof. Zhang wei June, 2012 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明 确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位 论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在 学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提 供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I 摘 要 目的：棉花枯萎病是一种在世界范围内普遍流行的土传的真菌性病害，严重影响棉 花生产，新疆是我国唯一的海岛棉生产基地，也是我国海岛棉枯萎病流行区。大量 研究表明，选育抗病品种是解决棉花枯萎病最为经济有效的措施。分子生物学技术 和生物信息学的不断完善和应用为棉花抗枯萎病品种的选育提供了新的途径。本研 究采用cDNA-AFLP技术结合RACE技术，从棉花抗病资源中挖掘抗病相关基因，研 究基因的表达特性，初步分析基因的功能，为进一步阐明棉花抗病的分子机制及抗 枯萎病棉花品种选育奠定基础。 方法：本研究以高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12号为材料，将材料水培至第三片 真叶展平时进行接菌处理，以未接菌材料为对照，利用cDNA-AFLP技术获得差异基 因片段，对差异片段进行同源性分析，结合RACE技术，获得基因的全长cDNA序列； 采用实时荧光定量RT-PCR技术对基因进行时空表达特性分析，并构建过表达载体和 干扰载体为研究该基因的功能提供基础条件。 结果：1：本研究利用cDNA-AFLP技术对棉花cDNA进行差异片段分离，得到94个差 异片段，选取48个差异片段进行克隆及测序，获得25条差异片段，在GenBank数据 库中进行序列信息比对，结果显示：21条基因片段在基因库中有同源序列，并且已 知生物学功能；3条基因片段在基因库中有同源序列但功能未知；1条基因片段在基 因库中没有同源序列。 2：通过对差异片段的同源性比对，选取其中一条差异片段，利用RACE技术， 对其进行全长克隆，获得全长后发现该基因与NBS-LRR类的抗病基因同源性很高， 编码框全长为1941bp，编码647个氨基酸，分子量为74.08KDa，等电点为5.35。将其 命名为GhNBS1。 3：通过实时荧光定量 PCR 技术对该基因在棉花不同器官和不同发育时间的表 达进行分析，从表达特征来看，该基因对棉花枯萎病菌胁迫敏感，在棉花根、茎和 叶中均表达，在叶片中表达量最高，茎中次之，根中表达量最低。在叶片中基因的 表达量随着时间的延长而增加，在 6h 时达到高峰，之后降低，在 48h 时达到最低值； 在茎中，该基因的整个表达趋势与棉花叶片相似；在棉花根中，在 6h 时达到高峰， 在其他时间点表达量很低。 4：构建了植物干扰载体与过表达载体，为后续研究基因的功能奠定了一定的基 础。 关键词：棉花，枯萎病，cDNA-AFLP，荧光定量 II II Abstract Objective:Fusarium wilt of cotton is a prevalent soil-borne fungal diseases in worldwide in cotton, and it will impact seriously cotton production，Xinjiang is Chinas only island cotton production base, our country are sea island cotton wilt endemic areas. A large number of studies have shown that the breeding of resistant varieti