绵羊体细胞核移植体系的建立与优化-生物学专业毕业论文.docxVIP

内蒙 内蒙古科技大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 摘 要 体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）即以去核卵母细胞为核受 体，将核供体细胞通过特殊人工手段移植入其中，获得核移胚后经体外发育成完整 个体的一种方法。为达到进一步建立和优化体细胞核移植体系的目的，本实验分别 对核供体细胞、卵母细胞体外成熟体系、胚胎激活及培养体系进行了优化，采用优 化后的体系制备绵羊体细胞核移胚，对其体外发育率进行了检测。具体研究内容及 结果如下： （1）体外培养绵羊皮肤成纤维细胞（sheep skin fibroblasts，SSFs），培养液中添加 不同浓度胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），测定其生长曲线；对体外培养的 SSFs 进 行 血 清 饥 饿 ， 采用 噻 唑 蓝 比 色 （ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定其增殖抑制率；采用三种方法（100%汇 合、血清饥饿及 100%汇合+血清饥饿）预处理体外培养的 SSFs，采用流式细胞技术 测定处于不同细胞周期的细胞比例。结果表明，本实验室冻存的 SSFs 形态良好；添 加 10% FBS 的 Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培养液适合 SSFs 的体外生长；SSFs 的增殖抑制率随血清饥饿处理时间延长而升高，处理 6 d 后达到 21.1%；100%汇合+血清饥饿法处理适合诱导 SSFs 进入 G0/G1 期，处理后处于该周 期细胞占总细胞数的 71.24%。 （2）对绵羊卵母细胞的体外成熟体系进行了优化，包括：卵母细胞的采集方法、体 外成熟培养方法、培养液中促卵泡生成素（folliclar stimulation hormone，FSH）、促 黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）及胰岛素转铁硒钠（insulin transferring selenium，ITS）的添加浓度。结果表 明，与抽吸法相比，切剖法更适合绵羊卵母细胞的采集，每枚卵巢可采集 2.35 枚卵 母细胞；微滴法与凹皿法的体外成熟率分别为 54.58%及 56.54%，两者之间差异不 显著（P＞0.05）；在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加 0.9 IU/mL 的 FSH 及 LH，50 ng/mL 的 EGF，1%（v/v）的 ITS 可使绵羊卵母细胞体外成熟率达到 80.37%。 （3）对绵羊卵母细胞的激活体系及胚胎体外培养体系进行了优化，包括：孤雌激活 过程中 6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）的处理时间、孤雌胚 体外培养液中必需氨基酸（essential amino acids，EAA）的添加浓度。结果表明，6- I DMAP 处理 4 h，能有效激活卵母细胞，孤雌胚的体外卵裂率及桑椹胚率分别达 70.75% 及 33.96%；SOFaa 液中添 2%（v/v）EAA 适合孤雌胚的体外发育，卵裂率 及桑椹胚率分别达 73.45% 及 36.28%；凹皿法与微滴法培养的孤雌胚体外卵裂率分 别为 72.5%及 73.56%，桑椹胚率分别为 35.83%及 36.91%，两者之间差异不显著（P ＞0.05）。 （4）采用上述优化体系进行绵羊体细胞核移植操作，采用机械去核、卵胞质内注 核、化学激活法构建绵羊体细胞核移胚，经体外培养，卵裂率及囊胚率分别达 45.26%及 13.95%。 关键词：体细胞核移植；皮肤成纤维细胞；卵母细胞；孤雌激活；绵羊 II Abstract Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a technology, in which enucleated matured oocytes were used as nuclear recipient, nuclear donor was transferred into nuclear recipient by specific artificial methods, reconstructed embryos then develop in vivo into individuals. In order to establish and optimize the procedure of SCNT, in the present study, the procedure of preparing of nuclear donor, as well as the