绵羊MBL基因启动子区CpG岛甲基化与绵羊支原体肺炎相关性研究-遗传学专业毕业论文.docxVIP

I I 摘 要 甘露糖结合凝集素（mannose- binding lectin, MBL）是一种由肝脏合成和分泌的急 性期蛋白，属于胶原凝集素家族，广泛存在于肝脏及血液中。MBL 通过激活补体和调 理吞噬作用在抗感染的起始阶段起主导作用，是一种重要的天然免疫防御分子。本试验 从羊 MBL 基因序列入手，结合绵羊肺炎支原体感染情况，探讨 MBL 基因启动子区甲 基化与绵羊支原体肺炎的相关性，为进一步诊断与治疗绵羊支原体性肺炎的提供重要的 理论依据，为优良品种的选育提供科学参考。 一、绵羊 MBL 基因启动子区的克隆及序列分析 为了得到绵羊 MBL 基因启动子区序列，本研究参照本实验室向 NCBI 提交的绵羊 MBL 基因序列（GenBank: FJ977629.1），设计 3 对特异性引物，以绵羊基因组 DNA 为 模板，采用 TAIL-PCR 技术扩增得到一特异性片段，经回收重组到 pMD18-T 载体，筛 选阳性克隆，测序。结果如下： 所测序列长为 679 bp，并通过生物软件和权威在线预测网站对其结构进行分析比 对，发现所获得序列内含 DEF、Ets、GAGA-1、TCF/LEF 和 Otc-3 等多种转录调控原件 和结合位点，本试验所得绵羊 MBL 基因启动子是 1 个无 TATA-box 但有 Ets 和 DPE 且 能正常转录的真核启动子，实验成功获得了绵羊 MBL 基因的启动子区序列。 二、绵羊 MBL 基因启动子区甲基化检测方法的建立 表观修饰是一类高于基因水平的基因表达调控机制，DNA 甲基化作为表观修饰的 核心内容，一直是分子生物学研究的热点之一。DNA 甲基化是脊椎动物 DNA 唯一的自 然化学修饰，在基因表达调控等方面发挥重要作用。基因启动子区及其附近区域内 CpG 甲基化的程度与转录的抑制程度关系密切。本实验中，选取患支原体肺炎的绵羊 4 只， 对肝脏组织提取 DNA，根据 BSP 法引物设计原则设计引物，采用 BSP 甲基化检测技术 对该基因启动子区序列进行甲基化检测。结果如下： 选用 BSP 甲基化检测方法成功地检测了扩增出的 234 bp 目的片段，甲基化分析发 现，感染 MP 绵羊 MBL 基因启动子区中的 6 个 CpG 位点有 5 个为甲基化位点，而正常 绵羊 MBL 基因启动子区中的 6 个 CpG 位点有 4 个发生甲基化，差异较大，证明本实验 建立的 BSP 甲基化检测技术平台准确可靠。 三、绵羊 MBL 基因启动子区甲基化与支原体肺炎相关性研究 MBL 作为人类天然免疫系统中重要的一线抗感染分子，已表明与多种疾病相关，如 一般免疫缺陷、特异性感染、囊性纤维病(CF)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎 （RA）等。绵羊支原体性肺炎是由绵羊肺炎支原体所引起的一种特异性感染疾病。本 研究选用 3 月龄绵羊 43 只构建试验群体（攻毒组 37 只，对照组 6 只），用绵羊肺炎支 原体（M.ovipneumonia）标准株 Y-98 对攻毒组进行气管内接种，运用 BSP 甲基化检测 II II 技术，成功检测了 37 只攻毒组绵羊及 6 只对照组绵羊中 MBL 基因启动子区甲基化及血 清中 MBL 浓度水平情况，结果如下： （1） 攻毒后，攻毒组中 MBL 血清水平呈降低趋势，且差异极显著（p＜0.01），而对 照组在统计学上未显示显著性差异； （2） 所选目的片段中共 6 个 CpG 位点，对照组有 2~4 个甲基化位点，主要集中在 CpG1、 CpG2、CpG3 和 CpG6 而位点 4、5 均未发生甲基化；攻毒组中有 4~6 个甲基化 位点，比较对照组而言，CpG3、CpG4 和 CpG5 甲基化显著（p＜0.05）； （3） 6 只攻毒试验中死亡的绵羊检测到甲基化并且血清水平 MBL 极显著（p＜0.01） 降低的标本中，CpG5 甲基化发生率极显著（p＜0.01）高于其它 5 个 CpG 检测位 点，CpG3 和 CpG4 甲基化发生率显著（p＜0.05）高于剩余 3 个 CpG 位点，而 CpG1 和 CpG2 位点甲基化发生率在攻毒组和对照组间则未见有统计学意义的差 异，提示 MBL 基因中启动子区靠近编码序列的 CpG 位点（CpG3、CpG4、CpG5） 甲基化对于调控 MBL 蛋白表达可能具有更为重要的意义。 关键词：绵羊，MBL，克隆，支原体性肺炎，甲基化 论文研究类型：A（基础研究） PAGE PAGE IV Abstract Mannan binding lectin (mannan-binding lectin, MBL), mainly in serum, is secreted by the liver to the mammalian blood