棉花油菜素内酯合成酶基因（GhDET2）在杨树上的遗传转化及转基因植株的表型分析-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

西南农业大学硕士学位论文 摘要 棉花泊莱索内酶合成酶基因 (GhDET2)在杨树上的遗传 转化及转基因植株的表型分析 生物化学与分子生物学硕士研究生严飞 指导教师裴炎教授 摘要 杨树是世界上最重要的人工林树种之一，在美化环缆、生态防护和工业用材上具有极其 重要的作用.我国是世界上杨树入工林面织愚大的国家.但是我国人均林地面积、森林蓄积 量和木材消耗量只占世界人均水平的 17.2%、12%和 17.6%. 目前，天然林中可采资源濒临枯 竭，大力发展人工杨将对缓解我国乃至世界森林资源渐趋缺乏、木材供需矛盾都起着非常重 要的作用， 传统的杂交育种方法为杨树良种选育作出了巨大贡献，取得了很大成就:但是，由于杨 树生 t?周期长、树体高大.这极大地限制了杨树传统育种工作的开展.在短时间内，用常规 育种技术要培育出人们所希望的杨树新品种是非常困难.现代生物技术的兴起，为林木遗传 改良提供了新的途径.植物基因工程通过基因操作将天然或构建的外源基因导入受体细胞基 因组中进行遗传转化，从而打破生物种间杂交障碍、扩大物种杂交的范围，大大加快了变异 j莲度，为木本植物定向育种提供了有效手段. 油莱索内酶 (Brassinosteroids ，BRs)早在 1982 年就被公认为是一类新型的植物生氏促进剂， 是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落自费和乙烯五大类激素之后的第六大类植物激素. BRs 参与植物生理过程的许多方面，对植物的生长发育具有多种生理功能，如:促进生长、增加 植物的抗逆性、延缓衰老、促进细胞的再分化等等.但最突出的生理作用就是促进植物的生 长。我国农业部已将它列入中国丰收计划进行广泛的推广应用，推广面积已接近 1000 万 亩 DET2 是编码泊莱索内酶生物合成途径中的 一个关键酶基因，它的突变将导致植物表现出 去黄化、矮化和丧失光调节机能等特征.而外施泊莱索内赔能回复 DE刀基囚突变所导致的突 变体表型。这说明 DET2 基因在泊莱索内黯生物合成以及植物正常生长发育中的重要作用.本 研究将来源于棉花纤维中 GhDET2 基因置于 CaMV35S 强启动子下转化杨树。通过在杨树上超 量表达 DET2 基因，增加杨树内源 BRs 的含量，进而促进杨树的生长，以期为杨树良种选育 11 11 两南农业大学硕士学位论文 摘要 提供新材料。主要结果如 f: 1: 建立了农杆菌转化毛臼杨茎段的遗传转化体系 通过对毛白杨叶片、茎段、根段 3 种外植体再生频率的研究，确定了以茎段为外植体 的高频再生体系，再生频率为 1∞%，平均每个外植体出芽数为 21.05 个.避而利用带内 含子的 GUS 基因瞬时表达技术，以转化频率为指标，确定了利于转化的Km选择压. AS 浓度、菌液浓度、共培养时间，建立了根癌农杆菌介导毛白杨茎段的转化体系. I!P: 用 500μmol儿的 As 二次稀释活化农轩茵茵液，待 ? cin，嗣为0.3-0，5 时侵染杨树茎段 I O-I5min.24 C黑暗条件下共培养划，黑暗条件下延迟筛选 I Od后以 50mgIL的 Km 进行 抗性芽的筛选培养，每 2ω 继代一次，将筛选出的抗性芽继代到含相同 Km 浓度生根培养 基上再笠成苗. 2. 棉花泊莱索内酶合成酶基因 GhDET2 的导入 采用携带重组质粒pGhD ET2 的农杆菌进行了目的基因的转化，获得了 Km 抗性芽 15 个. 5 株生根成菌，经 GUS 组织化学染包及 PCR 扩增，其中 3株 GUS 染色为阳性并扩增 出了与阳性对照相同大小的特异条带 (892bp). 说明外源基因己整合到杨树的基因组中。 3. 转 GhDET2 基因杨树的表型分析 将其中 GUS 染色较深且表型较明显的一株及对照同时进行扩繁，再生茵移栽入土钵，观 察其表型变化，结果发现转化植栋与对照相比，其株高、茎粗、节间长度、分枝数均明显高 于对照:切取转化植株的茎段进行水培，观察其生根情况，发现超量表达 GhDET2 基因杨树 的根系生长快而粗壮，侧根发达:对转化植株茎段切片的显微结构观察发现，转基困杨树木 质部的厚度、术射线细胞数、导管密度和木纤维的细胞密度均显著高于对照.分离出转化植 株的木质部纤维细胞，发现超量表达 GhDET2 基因杨树的木质部纤维细胞平均增长 148μm. 比对照提高了 28，97%. 关键词:杨树遗传转化农杆菌油菜京内醋 G最DET2 西南农业大学硕士学位文 AbSUlCt Transformation of Cotton Brassinosteroid Biosynthesis Gene