慢病毒载体介导HBVX基因稳定表达对HL7702细胞线粒体结构和功能的影响-内科学(消化)专业毕业论文.docxVIP

目 录 中文摘要1 Abstract 3 前 言5 第一部分 利用 In-Fusion 技术构建表达 3×Flag＆HBx 融合基因重组 慢病毒载体并鉴定 8 第二部分 稳定表达 HBx 的肝细胞株的构建和鉴定 25 第三部分 HBx 稳定表达对 HL7702 中 COXⅢ表达的影响及 HBx 与 COXⅢ细胞内定位 46 第四部分 HL7702/HBx 细胞中线粒体结构和功能的改变 57 结 论69 参考文献70 综 述79 致 谢97 PAGE PAGE 10 慢病毒载体介导 HBV X 基因稳定表达对 HL7702 细胞线粒体结构和功能的影响 中文摘要 目的：以慢病毒为载体构建稳定表达乙型肝炎病毒 X 基因(HBV X)的 HL7702 细胞株，探讨 HBV X 稳定表达对 HL7702 细胞线粒体结构和功能的影响。 方法：首先根据 In-Fusion 技术原理设计克隆引物，采用 PCR 技术从真核质 粒 pcDNA3.1-X 中扩增出含 HBV X 基因 DNA 全长片段，用 In-Fusion 交换酶将 PCR 产物与线性化慢病毒载体质粒连接, 经 PCR、测序、质粒表达检测鉴定。 将构建成功的重组慢病毒质粒 PLOV.CMV.eGFP.2A.3×Flag＆HBx.EF1a.Pura 与 包装质粒 psPAX2、包膜质粒 pMD2.G 三质粒瞬时共转染 293T 细胞以包装慢病 毒颗粒，慢病毒颗粒的滴度采用荧光定量 PCR 的方法检测。包装好的重组慢病 毒颗粒感染 HL7702 细胞，并经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达 HBV X 的细胞株 HL7702/HBx，并经过 RT-PCR 和 Western-blot 实验证实 HL7702/HBx 细胞内有 HBV X 稳定持续的表达。以半定量 RT-PCR 方法和 Western-blot 方法检测细胞色 素 C 氧化酶 III(COXIII)表达水平变化，酶动力学方法检测线粒体细胞色素 C 氧 化酶活性，流式细胞术检测细胞内 ROS 水平和线粒体跨膜电位，利用激光扫描 共聚焦显微镜采集荧光信号观察 COXIII 与 HBV X 蛋白（HBx）在肝细胞 HL7702 内的定位，扫描电镜下观察 HL7702/HBx 细胞线粒体超微结构的改变。 结果：成功构建表达 3×Flag＆HBx 融合基因的重组慢病毒表达载体，经 293T 细胞包装和浓缩后，重组慢病毒滴度为 8.61×107IU/ml。慢病毒感染 HL7702 细 胞后经嘌呤霉素药物筛选，得到稳定表达 HBx 的新细胞株 HL7702/HBx，经 RT-PCR 和 Western-blot 分析结果显示 HL7702/HBx 细胞能够持续稳定表达 HBx。 HBx 在细胞浆和细胞核中表达，而细胞浆中 HBx 可分布于线粒体，并与 COXIII 共定位表达。扫描电镜下发现稳定表达 HBx 的细胞线粒体较空白对照组和空载 对照组线粒体脊稍肿胀，细胞形态及结构无明显改变。半定量 RT-PCR 实验结果 发现 COXIII mRNA 表 达 水 平 无 明 显 改 变 ， Western-blot 实 验 结 果 表 明 HL7702/HBx 细胞内 COXIII 蛋白表达上调，线粒体细胞色素 C 氧化酶活性水平 升高，同时也发现细胞内 ROS 水平上升，而线粒体跨膜电位没有发生明显改变。 结论:成功构建稳定表达 HBx 的细胞株 HL7702/HBx。细胞浆中 HBx 可定位 于线粒体并与 COXIII 相互作用，通过转录后水平调节 COXIII 表达，从而提高 线粒体细胞色素 C 氧化酶活性和细胞内 ROS 水平，导致线粒体脊稍肿胀，但不 改变线粒体跨膜电位和细胞形态。 关键词: 慢病毒； X 蛋白；细胞色素 C 氧化酶 III；细胞色素 C 氧化酶； 线粒体跨膜电位；ROS Lentiviral vector-mediated HBx stably expression in HL7702 cell and the role of HBx on mitochondria Abstract Objective: To establish a HL7702 cell line stably expressing the HBx which transduced with a lentiviral vector. And to study the effect of HBx on a new HBx-interacted protein COXIII and mitochondria in HL7702 cells. Methods: Using the In-Fusion technolo