猪血超氧化物歧化酶联合提取及其活性检测研究1.docVIP

猪血超氧化物歧化酶联合提取及其活性检测研究 ［冃的］研究猪血超氧化物歧化酶(SOD)与其他生物活性物质的联合提取工 艺,为充分利用猪血资源和规模化生产SOD提供技 术基础。 ［方法］从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后，提取SODo通过 优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度 和缓冲液pH值，对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化。按照 优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力。［结果］ SOD活性测定的优化条件为50mmol/L邻苯三酚7g,l 50mmol/LTris-HCl(pH 8.2)3m,l反应温度为25°C,SOD样液添加量为lOglo 联合提取的SOD的比活力达到5 056U/mg蛋白质。［结论］通过现代生物工程 集成技术从猪血中分级提取了 4种生物活性物质，所提取的SOD具有较好的活 性。 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是广泛存 在于好氧微生物和动植物中的金属酶［1］,它能够清除超氧阴 离子自由基,从而有效地防御活性氧对生物体的毒害作 用［2］,具有抗氧化、抗炎症、抗衰老、抗癌、抗突变、抗辐射等 功能，其制品已经被广泛用丁?医药、食品、化妆品、保健品等。 动物血细胞中含有大量的SOD,国内学者利用我国丰富的动 物血资源，对从动物血中提取SOD的工艺进行了大量的研 究，但这些研究都是从动物血屮进行单一 SOD的提取， 生产成本较高，在实践中难以推广应用。该研究以猪血为原 料,利用现代生物工程集成技术，探讨猪血中SOD等多种活 性物质的联合提取工艺，从而为猪血SOD规模化生产和猪 血资源的合理利用奠定基础。 1材料与方法 1.1猪血的采集猪血采自河南郑州市肉联厂提供的各项 检测指标均合格的健康成年猪，加入38 g/L柠檬酸三钠 抗凝。 1.2生物活性物质的分离 将抗凝健康猪血3 000 r/min离 心20min,获得的上清液和沉淀分别为血浆和血细胞。在 20%饱和硫酸鞍(pH 7.0;山东大明消毒科技，中国滕州)中 对血浆进行盐析。离心后，沉淀的主要成分为纤维连接蛋 白。在50%饱和硫酸钱(pH 7.0)中对离心后的上清进行第 2次盐析，离心后，沉淀的主要成分为免疫球蛋白。将等体积 蒸馆水加入血细胞沉淀中，搅拌30min使其混匀并溶血。离 心后,滤液可采用有机弱酸HA-有机弱碱BOH作溶剂，以无 机强碱调节pH值为5?6,血红素析出［6］。滤渣备用于SOD 的提取。 SOD的提取 SOD的粗分离。向溶血过滤后的滤渣中加入等体积 的蒸憾水，剧烈搅拌混匀，于4°C静置过夜，使其充分浸润。 再向其中缓慢加入0. 2倍体积的-20°C预冷的95%乙醇 和0. 1倍体积预冷的氯仿搅拌15mino静置1 h后,3 500 r/min 离心25min,收集上清液即SOD粗品液，记录其颜色和澄 清度。 SOD的纯化。采用热变性一等电点一丙酮分级沉淀 合用的方法[7]。首先将SOD粗提液先在55°C下处理15 min[8],然后调节pH值至其等电点3?4,最后加入终体积为 1.0%的丙酮，收集沉淀。向沉淀中加入去离子水，溶液即为SOD提纯液。采用 DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。分别记录 SOD提纯液和精品液的颜色和澄清度。 SOD活性测定条件优化 1.4.1邻苯三酚的用量。取7支试管分别加入3 ml 50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8.2;Tris,于(25±0. 5)°C 的恒温水浴 中温浴10mino然后，将5、6、7、8、9、10卩1同样温浴的邻苯 三酚溶液分别加入试管中，迅速摇匀， 立即倾入1 cm比色杯中,UV 2000紫外可见分光光度计测定OD325,每隔30 s 测定1次，连续记录5min,以自氧化速率控制在0.058?0.072AOD325/min标准来 确定邻苯三酚的加入量。最后一管不加邻苯三酚溶液，作为参照。14 2 SOD 样液添加量。在2支试管中分别加入3 ml50mmol/L的Tris-HCl (pH 2),然后 分别加入10、20pdSOD样品液(比活力＞5 000U/mg蛋白质汙(25±0.5)°C的恒温 水浴中温浴10 min。然后，将7(11同样温浴的邻苯三酚溶液分别加入试管中，迅 速摇匀， 倒入1 cm比色杯中，测定OD325,每隔30 s测定1次,连续记 录3min。调节样液体积，使样液中邻苯三酚的氧化速率控 制在(0.034±0.002)AOD325/min,记录此时样液体积。以不 加SOD样液的空白管作为对照。 SOD样液添加量。在2支试管中分别加入3 ml 50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8. 2)，然后分别加入 10、20pl SOD样品液