枯草芽孢杆菌基因组简化及其对核黄素和胸苷生产的影响-生物工程专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘要 构建基因组最小化底盘细胞是合成生物学的重要研究内容。本研究旨在构建 枯草芽孢杆菌基因组最小化底盘细胞并测试其生产核黄素和胸苷的能力。 在已删减约 200 kb 基因组的枯草芽孢杆菌菌株 BSZ11 的基础上继续进行基 因组删减。利用基于 upp 负筛选基因的双交换重组策略依次删除 ynxB-dut、 yoaV-yobO、pdp-rocR、ycxB-sipU、yisB-yitD、yrkS-yraK 和 yybP-yyaJ 七个基因 组区段，最终获得基因组简化了 500 kb 的菌株 BSZ18。 之后，测试基因组简化程度不同的菌株核黄素生产能力。发现随着删减程度 的增加，核黄素的产量也随着提高。BSZ18 比未删减菌株 BSZ（ribC*）核黄素 产量提高了 20%。进一步将携带核黄素操纵子的质粒 pMX45 导入测试菌株中显 著的提高了核黄素产量。发酵结果仍然遵循核黄素生产能力随删减长度的增加而 增加的趋势。导入 pMX45 之后，BSZ18 的核黄素产量是未删减菌株的 2.3 倍。 另外，我们还初步测试了已删减 745 kb 基因组的枯草芽孢杆菌 BS745 生产 胸苷的能力。在 BS745 中敲除嘧啶回补途径基因 tdk（获得 BST745）可积累 12.46 mg/L 胸苷，然而基因组未删减的对照菌株敲除该基因后未在培养基中积累胸苷。 在 BST745 中分别强表达胸苷合成途径基因（ushA、thyA、dut、ndk）以及嘌呤 代谢途径的关键基因（prs 和 ywlf）可以将胸苷产量提高 50%和 27%。然而在未 删减菌株中，同样的基因修饰却只能检测到 2.55mg/L 和 1.93mg/L 的微量胸苷积 累。这些结果表明基因组简化菌株相较未删减菌株具有较好的核黄素和胸苷合成 能力,在后续的研究中有潜力作为底盘细胞构建高效的细胞工厂。 关键词：枯草芽孢杆菌，基因组最小化，底盘细胞，核黄素，胸苷 ABSTRACT Engineering chassis cells with reduced genome is an important research aspect in synthetic biology. The aim of this study was to construct reduced genome Bacillus subtilis strain and to test its ability for the production of riboflavin and thymidine. We proceeded genome reduction from BSZ11 which was a Bacillus subtilis strain with 200 kb sequences deleted in the genome. Using double crossover recombination with upp as counter selectable marker, we deleted ynxB-dut, yoaV-yobO, pdp-rocR, ycxB-sipU, yisB-yitD, yrkS-yraK, and yybP-yyaJ genome region and finally constructed strain BSZ18 with 500 kb genome sequence deleted. We then tested the ability of strains with varied deleted genome length for the production of riboflavin. We found that riboflavin production increased as genome sized reduced. Riboflavin production in BSZ18 increased 20% compared with undeleted strain. Further introducing plasmid PMX45 containing riboflavin operon into the tested strains significantly increased riboflavin production and the results followed the same trend that riboflavin production increased as genome size reduced. With PMX45, BSZ18 yielded 2.3-fold higher rib