米曲霉氨基酰化酶的固定化及其拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的分析-化学工程专业毕业论文.docx

摘要 摘要 本文首次以氨基默化酶为酶源拆分非天然氨基酸 -N-乙酷-DL-苯甘氨酸。实 验首先以固定化米曲霉菌体为酶源在间歇反应器中进行初步拆分，进而利用拆分 效率相对较高的固定化酶在连续床中进行最后拆分。本文采用理论分析与实验研 究相结合的方法，综合运用数学建模、过程模拟等多种手段，对氨基默化酶拆分 N-乙酷-DL-苯甘氨酸的酶解体系进行了较全面系统的研究，内容涉及菌体的培 养、菌体和酶的固定化及其性质表征、酶分子的作用机理及酶促反应动力学、反 应器的模型计算等方面，主要包括 l 通过对各种不同类型培养基的比较，筛选出了适宜的液体培养基一豆汁培 养基，得到了菌体培养的适宜条件: 30C ，pH 值自然，转速 130rpm ，接种量4 %，培养 40h ，该菌体用于拆分N- 乙酌-DL-苯甘氨酸时菌体的比酶活可达 1600-1800Ug，l ，以甲M为交联剂，惰性蛋白明胶为包埋剂和活性保护剂，对米 曲霉菌体进行固定化。在正交实验的基础上利用人工神经网络得到了较优的固定 化条件 z 菌体与固定液的用量比(固液比)为 1:8，其中固定液中明胶浓度为0.5% ， 甲醒浓度为 0.5悦，固定化时间为 l .5h ，在此条件下制得的固定化菌体比酶活达 到 1500Ugl，酶活保留率超过 80%。固定化后米曲霉菌体热稳定性明显增强， 在连续反应器中的操作半衰期可达 77d ，最佳反应条件pH 值从 7.0 变为 8，0 、温 度由 52C变为 63C ，最适反应条件明显变宽。Coφ浓度为 1X lOJmol.L1 时对固 定化菌体的激活作用达到最强。 2 研究了固定化米曲霉茵体拆分 N- 乙M;-DL-苯甘氨酸的的催化特性。当底物 浓度大于 200mmolL，1 时，产生底物抑制。产物乙酸和 L苯甘氨酸 (L-PG) 分别 产生非竞争性抑制和竞争性抑制。在 37C 条件下，固定化菌体的米氏常数 K 、 底物抑制常数 KiX 、产物乙酸的抑制常数瓦，AC 和 L-苯甘氨酸的抑制常数尺，用分别 为 19.8mmolL1、225.5mmolL1 、38.7mmolL1 和 20.23mmolL I， 3 从酶反应动力学基本方程出发，考虑各种抑制物的作用特点，提出了新的 分子作用机理，建立了新的动力学方程。固定化菌体在间歇反应器中的实验数据 表明，当底物浓度较低时，该方程与 W缸burton 方程和 Cleland 方程均能很好地 与头验结果相吻合:随着底物浓度的增大和反应的进行，除新的动力学方程仍能 很好地与实验结果吻合外，其它两个方程与实验结果的偏差越来越大，表明本文 提出的分子作用机理更为合理。 4 采用结构与 DEAE-Sephadex 极其相似的大孔弱碱性树脂 DEAE-EIH 作为氨 基因先化酶的固定化载体。考察了影响固定化结果的因素，确定了适宜的固定化条 夭津大学申请博士学位论文 件:自由酶液浓度为 120Umr ， pH 值 6.5 左右，温度为室温。在此条件下制得 的固定化氨基酷化酶比酶活可达 1200-1500Ug-l ，酶活保留率超过60% ，与文献 报道的 DEAE-Sephadex 固定化效果相当，固定化后酶的稳定性太太提高。固定 化酶的米氏常数 Km 、底物抑制常数几、产物乙酸和苯甘氨酸的抑制常数Ku，.;JU K; 阳分别为 5.668mmolL-、763mmolL- 1 、400mmol 1-1 和 10.Ommol 1-1 0 5 对固定床反应器中固定化氨基融化酶连续拆分 N- 乙耽-DL-苯甘氨酸的反 应进行模拟，用推广的割线法求解模型，模型的计算值与实验结果吻合较好。最 后所得产品 D-苯甘氨酸的旋光度为 [αl;;: -1570 CC= l， lmol.L- 1 HCI)，产品 的光学纯度为 99.4%。理论收率达到 65.1%。 关键词:米曲霉 CAspergillus 0明时，固定化酶(菌体). D-苯甘氨酸，拆分， 抑制，反应机理，填充床反应器 英文摘要 ABSTRACT Immobilized enzyme (mycelium) technology，as a new technology，was used in various fields，and the optical resolution of amino acid was one of the major applications. In this paper，aminoacylase from Aspergillus oryzae was used to resolute N-Ac-DL-phenylglyci 肘， which was the materials of semi-synt