毛乳头体内再生诱导模型的建立-病理学与病理生理学专业毕业论文.docxVIP

汕头 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头 汕头大学医学院硕士学位论文 中文摘要 目的 1、建立单个大鼠触须毛囊上段裸鼠皮下移植方法，利用大鼠触须毛囊培养液作为促进 毛乳头（dermal papilla，DP）再生的诱导来源，建立 DP 体内再生诱导模型； 2、追踪 DP 再生的完整过程，观察毛囊培养液对 DP 再生率的影响； 3、追踪模型中新生 DP 的细胞来源； 4、选取与毛囊真皮成分发生密切相关的 Wnt5a 信号分子：①追踪 wnt5a 在 DP 再生过 程中的时空表达；②观察 wnt5a 在大鼠 DP 胚胎发生前后的表达模式；②对比 DP 体内 诱导模型与大鼠 DP 胚胎发生过程 Wnt5a 的表达模式，初步探讨 DP 再生机制。 方法 1、DP 体内再生诱导模型制作 ①大鼠触须毛囊上段移植体的制作和鉴定：用显微器械肉眼分离得到 SD 大鼠触须毛 囊，以镊子轻轻夹住毛囊上端并挤压，暴露毛囊下端红色的含毛乳头的毛球部，镜下 紧贴毛球部上方用新剃须刀片将其横向裁切，得到大鼠触须毛囊上段标本。随机抽取 大鼠触须毛囊上段标本和切除的毛球部，扫描电镜观察是否完整切除毛球部。 ②毛囊培养液的应用：取大鼠触须毛囊上段标本时，挑选出移植用的生长期毛囊， 其余毛囊（100-140 个），加入含 10%血清 DMEM 培养基培养，隔天换液。第 2、4、6、 8 天换液时留取旧液用灭酶的小管保存，1h 内裸鼠注射，注射于裸鼠毛囊移植点皮下， 0.1ml/移植点。 ③单个大鼠触须毛囊上段裸鼠皮下移植： 实验组：毛囊上段移植体用毛囊移植笔以 30-45 度角注射于裸鼠皮下，每个毛囊距 离 1-1.5cm，背部左右两侧各三个。移植后第 2，4，6，8 天分别注射毛囊培养液； 对照组：移植方法同实验组，但移植后第 2，4，6，8 天分别注射含 10%血清的 DMEM 培养液。移植后定期拍照、取材、制作石蜡切片，观察形态学变化。 2、新生 DPC 来源追踪 ① 分组：毛囊上段 BrdU 浸泡标记组：大鼠触须毛囊用含 5μmol/L BrdU 的 10%血清 DMEM 培养基浸泡 4 小时后再切除毛球部，裸鼠皮下移植； 大鼠 BrdU 标记组：每隔 2 小时对大鼠腹腔注射 5mg/kg 的 BrdU，连续注射 4 次后处 死大鼠，取触须毛囊，切除毛球部后进行裸鼠皮下移植； I PAGE PAGE VI III III BrdU 裸鼠注射标记组：正常大鼠毛囊切除毛乳头后进行裸鼠皮下移植，取材前 2h 裸鼠腹腔注射 5mg/kg 的 BrdU， 2h 后处死取材。 ② 定期取材，制作石蜡标本并切片，荧光免疫组化追踪 BrdU 的表达情况。 3、Wnt5a 在大鼠毛囊胚胎发生和大鼠触须毛囊上段裸鼠移植诱导 DP 再生模型中表达 的对比 ① 荧光免疫组化法观察 wnt5a 在大鼠触须毛囊上段裸鼠移植诱导 DP 再生过程的时 空表达情况。 ② 大鼠 DP 胚胎发生过程 Wnt5a 的表达模式：分别取 E12.5、E13.5、E14.5、E15.5 胎龄的大鼠胚胎，固定、制作蜡块、切片，HE 染色观察表皮和真皮形态变化，免疫组 化观察 wnt5a 表达情况及时间变化趋势。 ③ 对比 DP 体内诱导模型与大鼠 DP 胚胎发生过程 Wnt5a 的表达模式，初步探讨 DP 再生机制。 结果 1、DP 再生模型制作 ① 大鼠触须毛囊上段切除效果鉴定：电镜扫描结果显示，毛囊切面光滑，切除方法 效果良好，外层有结缔组织鞘包裹整个毛囊结构，内部可见外根鞘包裹毛根，未见毛 乳头。由于毛乳头部位无毛根，因此可以确定毛乳头已被完全切除。 ② DP 再生诱导模型形成过程观察：移植术后的裸鼠背部可见移植点距离均一，伤 口微小，流血少，伤口恢复迅速。至第 3 天移植部位周围皮肤长出细密毛发。第 22 天 在其中一个移植点观察到一根触须样的毛发纤维。大鼠处死后观察：移植的毛囊上段 没有移位。移植的毛囊上段已向下生长形成完整的毛球部，毛球部形态与触须毛囊相 似。毛囊周围血供丰富，毛囊上段可见一条类似毛球部血供的红色线状结构，轻轻挤 压此结构，可见毛囊下端突出于红色的含新生毛乳头的毛球部。 HE 染色观察：对照组和实验组大鼠在毛囊断端都有新生的结缔组织包裹形成鞘状， 但对照组大鼠毛囊形成的结缔组织鞘形状不规则，在毛囊断端形成明显凹陷，新生成 的结缔组织鞘内有血供形成，但细胞数稀少，没有形成毛乳头。实验组大鼠触须毛囊 上段移植后第 3 天,毛囊断端已被结缔组织包裹,结缔组织鞘已经完整，中部断端处稍 向内凹陷，但切断痕迹并不明显，内部有细胞填充，但数量较少。移植后第 7 天, 结 缔组织鞘增厚，毛乳头外周开始形成，内有血管，毛乳头外周也有大量细胞聚集，血 供丰富。移植后第 9