浙大植物生理学报告植物衰老生理.docVIP

沖戸丿、岁实验报告 专业：生物系统?丁程 姓名： 缪宏樑 学号： 3120100211 日期： 2014.5.29 地点：生物实验屮心313 课程名称：植物牛理学实验指导老师：成绩: 实验名称：植物衰老牛?理实验类型：定量 同组学生姓名： 朱圣日美 二、实验内容和原理四、实验方法和步骤 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 一、 实验目的和要求 1.掌握可溶性蛋白测定的原理; 2-掌握植物组织中丙二醛的测定方法; 掌握植物组织中超氧物岐化酶(S0D)活性测定方法； 了解植物衰老的原理。 二、实验内容和原理 衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。 衰老时的生理生化变化:蛋口质显著下降，核酸含暈的变化，光合速率下降，呼吸速率下降，生物膜结构变 化，植物内源激素的变化等。 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少(可溶性蛋白)。 自由基代谢失调，并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA 可溶性蛋白测定的原理 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm,并表现出在595nm 处的吸收值与溶液屮的蛋白质含量有线性关系，其范围从0^1000 g/mL据此可制作蛋白质的标准曲线， 牛血清蛋白为常用的标准蛋白。 待测样品经缓冲液提収后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提収液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测 定595nni吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。 MDA测定原理： MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处 消光系数为155 (mM)-l cm-1 超氧物岐化酶(SOD)活性测定原理： SOD 20穿 +2比0 H2O2+O2 四氮哇蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的02.-能将NBT还原为蓝色的甲踪，甲腺在 560nm波长有最大吸收，而SOD能清除02.-抑制甲腺的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对02.- 的抑制率，可以表征出SOD含量。 三?实验材料和主要仪器 实验材料：叶龄差异明显的叶片若干 主要仪器：分光光度计，天平，离心机等 四、实验方法和步骤 可溶性蛋白测定 （1） 制备蛋白提取液 称叶龄差异明显的叶片各0. 50g ,加入5ml磷酸缓冲液（50mmol, pH值为7. 8）,于冰浴中 研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下（4°C）离心lOmin,其上清液即为蛋口提取液。 （2） 蛋白标准曲线的制作 蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0. 15M NaCl溶液中，制成lmg/ml 的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160ug/200ul牛血清蛋白的标准溶液。 考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制 准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160 u g牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试 管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min,用lOmni厚的比色杯 在595nm下比色读取0D值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。 （3）显色反应 样品的测定： 取40山蛋白提取液+160皿磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后 放置2min,用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取0D值。对照为空白的磷酸缓冲液加上 4. 8ml考马斯亮蓝溶液。 MDA测定 取上清液1. 0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4. 0ml,然后在离心管盖上戳一小孔, 92°C水浴保温30min 空白管：lmL Pi-buffer +TBA与TCA混合液4.0ml （92°C水浴30min）冷却后，平衡，离 心 5min; lOOOOrpm 测定 A532, A450 和 A600 超氧物岐化酶（SOD）活性测定 称叶龄差异明显的叶片各1. 0g ,加入5ml磷酸缓冲液（50mniol, pH值为7. 8）,于冰浴中 研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4 C）离心10min,其上清液即为酶提取液。 在暗光条件下加入3mL NBT反应液和100 u L酶提取液于试管中，在25°C照光 （4000-100001ux）并计时,6-25min后出现颜色变化，9min后测560nm0D值。同时作空白实 验。 根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（imit/gFW）。一个酶活单位相当于引起 3mL曲T反应液 达到50%抑制所需要的酶量。测定时用未照光NBT反应液调零。 五、实验数据记录和处理 ①可溶性蛋白测定 标