荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应.docVIP

荧光光谱法在生物分析中的应用 —-亚甲基蓝与蛋白质的结合反应 刘超-生物化工-2009010236 荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。荧光测 试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中 荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。在生物体中，蛋白质是 必不可少的生命物质，有关蛋口质的各类研究，是冃前生命科学、化学和临床医 学中共同关注和感兴趣的课题。亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1） 的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用 于亚硝酸盐、磺氨类、氧化物及一氧化碳等中毒的解毒药。近年来又发现MB对 DM\具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及 作用机理与血吓咻很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学 治疗。新近的研究述表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。本文 应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互 作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋 白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数 据。 实验方法：配制0. 05mol/L的Tris-HC1并含0. 10mol/LNaCl的缓冲溶液 （pH=7. 0）,恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备 液。测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA, MB溶液，以缓冲溶液 稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1 的MB吸收光谱，测定屮固定BSA的浓度而改变MB浓度。 结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起 荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性, 表明室温下MB对BSA的荧光猝灭为静态过程。为进一步证实此猝灭特征，把此 过程按动态猝灭处理，即式（1） Fq/F = 1 + Kqs[〃t] = 1 + 心.[0] （1） 称为Stern-Volmer猝灭方程，K。为双分子猝灭过程速率常数，^sv为动态猝灭常 数，为猝灭剂不存在时荧光体分子平均寿命，[°〕猝灭剂的浓度。而 Ksv = Kq，Kq二Ksv/%,由于生物大分子荧光平均寿命约为IO8 s,故 可由猝灭曲线的斜率求得猝灭常数。由图2实验数据，按式（1）可以求得MB对BSA 猝灭的Ksv = 2.50 x 105 L ? mol1, = 2.50 x 1013 L ? （mol ? s）1,而各类 猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2?°x 10,（） L?（mol?s） 显然MB对BSA荧光的猝灭过程速率常数远人于扩散控制的5,可见其猝灭过程确为形成化合物所引起的静态猝灭，而不是由丁动态碰撞引起的动态猝灭。 Fig. 2 Effect of MB on the fluorescence spectra of BSA ［＞H = 7.0,25cC，LBSA］ = 1.0x 10mol?L J［MB］（ 10、nioIHr1 ）, a to 1:0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.2 在静态猝灭作用屮，静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光体-猝灭剂分子 间的结合常数表达式推导求出。设生物大分子P与药物D成键时有n个等同且独立 的结合位置，则有下述反应：卩+ nD?Df ⑵其 中0尸为生成物，相应的结合常数为 心=（3）设生物大分子的总浓度为 ［人：，药物的总浓度为［〃丄 则由反应（2）的计量关系可得： ［叩=［幻+ ［射］，［0］ = 口］ _ nLDrlPl当反应体系中仅有 牛物大分子P为荧光体时，则有他/=1人〕/［」，这里八Fo分别为加入和 不加入药物D时浓度为IP」的生物大分子溶液的荧光强度。将这些浓度关系代入 式（3）可得 F°/F =心［。］尸（＞/（几一 F）- nKA［ Pt 1 （4）固 定浓度［P』而改变［0］,按式（4）的线性关系可以确定Ka与庶 根据图2的MB对BSA荧光发射谱的猝灭关系，将343mn处的相对荧光强度实验 数据按式（4）以F°/F对［Qt］F0/（F0 -）做一元线性回归，由回归系数 可进一步求出MB与BSA反应时的结合常数Ka =3.44x 1（P Lemol_,,结合位点数n=1.03,相应的线性相关系数为0. 9988o这一结果表明MB与BSA有较强的 结合作用，且可形成一个结合位点，并服从独立等同的位点结合模型。 若小分子化合物与血清白蛋白的结合为顺序结合，则依据Fi