利用七叶灵显色技术检验和判断p一葡萄糖苷酶的-食品与发酵工业.PDF

利用七叶灵显色技术检验和判断p一葡萄糖苷酶的研究+ 赵林果，孟 鹏，李丽娟，余世袁 (南京林业大学化学工程学院生物工程系，江苏南京，210037) 摘 要 七叶灵(6，7—2一羟基一香豆素一p一口葡萄糖苷)在p葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原(6，7-2一 羟基一香豆素)，七叶苷原能和Fe”作用呈现棕黑色。七叶灵显色技术用于p一葡萄糖苷酶高产菌株的筛选、8一葡 萄糖苷酶提纯时的样品检测、非变性聚丙烯酰胺凝胶活性染色的应用结果表明，以七叶灵为作用底物检验和判 断B_葡萄糖苷酶的新方法具有高分辨率和灵敏性，而且操作简易、快速、经济。 关键词B一葡萄糖苷酶，检验，七叶灵，新方法 在纤维素的生物降解和一些香味前体物的释放 在8一葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原 过程中，B一葡萄糖苷酶起着重要的作用[】’2]。在研究 (6，7—2一羟基一香豆素)，七叶苷原能和Fe3+作用呈现 该酶的过程中，相继报道了多种B一葡萄糖苷酶活性的 棕黑色[9]。作者根据这一原理，将七叶灵显色技术用 测定方法。其中常用的有以水杨素作底物，将水杨苷 于p一葡萄糖苷酶高产菌株的筛选，8一葡萄糖苷酶提纯 裂解为水杨醇和葡萄糖，然后对所产生的葡萄糖用 时的样品检验，非变性聚丙烯酰胺凝胶的活性染色。 研究结果为从事该酶的研究开发，特别是大量酶样品 DNS(3，5一硝基水杨酸)试剂显色后进行比色测定’33； 以纤维二糖为底物，用葡萄糖氧化酶试剂盒测定生成 以及不同性质的B一葡萄糖苷酶的分析判断提供了一 的葡萄糖量[4o；以对一硝基苯基一G-D一葡萄糖苷种灵敏、快速、经济、简便的新方法。 (pNPG)为底物，酶解后释放出来的对一硝基苯酚可直 1 材料和方法 接在400420nm之间进行比色测定[5]。但使用葡 萄糖氧化酶试剂盒和pNPG的成本较高。 1．1产酶菌株的筛选及酶样品的制备 除定量测定G一葡萄糖苷酶活性以外，现在也研究 1．1．1 供试茵种及其活化 开发了几种能定性分析或鉴定B一葡萄糖苷酶的显色 Aspergillus 技术。如，在聚丙烯酰胺凝胶电泳染色时，将凝胶保 温在对一硝基苯基一口一D-葡萄糖苷溶液中，会在B一葡萄 糖苷酶的位置处出现由硝基酚引起的绿色条带。但 其准确性不够，而且由于硝基酚具有较高的扩散性， 实验室保藏。4℃保存在PDA平板培养基中。使用 前将菌种在无菌条件下接人PDA平板培养基中，置 其条带会很快逐渐消失[6]。Rissler利用6一溴一2一萘 基一B-p葡萄糖苷为电泳凝胶的保温溶液并以重盐为 于28℃培养箱培养3～4d。孢子长满斜面后用无菌 水制成孢子菌悬液，其中孢子含量为5×106个／mL。 作用试剂，酶的降解产物溴萘酚在重盐的作用下形成 1．1．2液态发酵基本培养基及产酶条件 红色沉淀。由于重盐的感光性，该技术对操作过程要 采用质量浓度4％的麸皮为碳源，氮源及无机盐 求苛刻H]。另外一种方法是使用4一甲基伞形酮一n葡 与Vogel培养基‘103相同，接种量的体积分数为2％。 萄糖苷作为底物，经B一葡萄糖苷酶作用后分鳃为4一 r／ 在初始pH值5．0，培养温度30。C，振荡速度150 甲基伞形酮，利用4一甲基伞形酮具有强烈荧光的特