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分子医学技能实验;基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。
是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。 ;核酸分离纯化的总原则:
? 保证核酸一级结构完整
? 排除其它分子的污染:
细胞内:蛋白质、脂类、糖、RNA等
提取过程中:有机熔剂、金属离子、外源DNA ;细胞样品的核酸提取的主要步骤;核酸提取注意事项;二、人基因组DNA的制备;分离纯化基因组DNA的常用方法:;实验材料及试剂;主要试剂的功能;取材:用生理盐水漱口后,口含生理盐水10~15ml约2~3min,用15ml离心管(4000rpm ? 10min)收集细胞沉淀 ①
(离心机的使用,平衡)
?
加入0.5ml抽提缓冲液,重悬沉淀 ,转移至1.5ml EP管
(微量移液器的正确使用)
混匀,65℃ 温育30min
?
加入等体积的饱和酚(0.5ml),充分颠倒混匀;12000rpm?5min②,上层水相转移至新的EP管
(高速离心机的使用与安全意识)?
加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒混匀
12000rpm?5min,上层水相转移到新的EP管 ?;弃上清,沉淀中加入75%乙醇
?
12000rpm?2min ④
?
轻轻弃去上清,打开EP盖,室温静置5~10min
加入30?l0.1×TE溶液,充分混匀后检测结果?;分子医学实验注意事项;实验结果及其分析;常见问题:
1、提取的DNA不纯:
变性不充分;关键过程反应时间过短;
离心时间或速度不够。
2、提取的DNA成涂布状:
操作过程中用力过猛,动作粗暴;
操作系统有污染。
3、与细胞器DNA分离不全;
变性过程不完全;
试剂配置问题。
;
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