锁核酸在抗病毒基因诊断与治疗中的应用新进展.docVIP

锁核酸在抗病毒基因诊断与治疗中的应用新进展 基因是现代研究的一个新领域和新热点，PCR技术因准确度和特异性 高、灵敏度好等优点受到了医学工作者的青睐。PCR技术能在早期及时发 现疾病，做到早预防和早治疗。而基因治疗中的反义寡核昔酸治疗和核酶 是从分子水平对疾病进行干预和治疗，具有从源头治疗的优点。但天然的 寡核昔酸稳定性差，容易被各种核酶迅速降解，给研究应用带了一大难题。 因此需寻找一种物质对寡核背酸进行修饰，增加其抗酶切能力和提高其稳 定性。近年來，锁核酸因其具有稳定性好、分子杂交能力强、抗核酸酶降 解能力高、脂溶性好和低细胞毒性等特点而被人们应用于基因诊断和基因 治疗。笔者就锁核酸的理化性质、基因诊断与治疗中的应用新进展作一综 述，以期为其在病毒诊断、治疗中的应用提供潜在的研究价值。 锁核酸的化学结构与理化性质 1?1化学结构 锁核酸(lOcked nucleic acid, LNA)也称桥核酸，是 一种化学结构较特殊的双环状核昔酸衍牛物，其分子结构中含有一个或多 个2’ -0.4 -C-亚甲基-B-D-咲喃核糖核酸单体,核糖的2’ -0位和4 -C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并 连接成环形，形似锁状或桥状，这个环形桥锁定了咲喃糖C3, -内型的N 构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架的局部结构的稳定性。 LNA的特殊构象能够导致核酸骨干的预组装，在某种程度上增加碱基堆积 力，有利于双链形成。 2理化性质由于LNA化学结构的特殊构象，其理化性质比其他寡核 昔酸具有更突出的??势：①提高与补序列的杂交高亲和性：因为LNA碱基 与DNA、RM的磷酸盐骨架相同，LNA碱基与互补序列杂交时不但具有更高 亲和力，而口这种相同的磷酸盐骨架能使互补序列被LNA容易识别，从而 形成高亲和力的杂交物。②增加互补双链的热稳定性：LNA单体增加到寡 核昔酸链中时，其解链温度(Tm)可明显提高，在LNA与DNA形成的杂交 双链中，Tm可提高2°C-6°C,在LNA与RNA形成的杂交双链中，Tm可提高 3°C-9°C,可见与互补双链的热稳定性明显增加。③改善抗核酸酶切割能 力：血液中siRNA不稳定，极易被大量的核糖核酸酶迅速分解，在siRNA 3 末端被LNA单体修饰后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清屮的半衰期明 显提高。④LNA的无毒性：注射反义LNA后，通过检测小鼠血清肝肾功能 生化指标和病理切片HE染色，未发现有明显变化。⑤LNA与DNA或RNA结 合时，错配辨别力更强。⑥LNA水溶性好，自由出人细胞，易被机体吸收。 正是因为LNA所具冇的这些优势，近年來不管是在基因诊断还是基因治疗 中，LNA成了学者的研究热点。 LNA在抗病毒诊断中的应用 2.1乙型肝炎病毒(HBV)检测在治疗慢性乙型肝炎时，核背类似物 如拉米夫定(LAM)、替比夫定、阿德福韦(ADV)等被长期应用于抗乙肝 病毒(Hepatitis B Virus. 1IBV)治疗并一定程度上抑制了病毒的复制。 但是长期使用这些抗病毒药物可使病毒基因发生变异，产生耐药，最终引 起无效治疗和影响后期的康复。因此，测定先存或新形成的HBV抵抗菌株 在临床治疗中对抗病毒治疗方法选择有着重要意义。目前检测耐药HBV 一 般由直接测序法完成，但是这种方法耗时，更重要的是无法同时检测混在 同一样品中野生型和变异型的种群，因此不适合常规的临床应用。普通PCR 扩增病毒DNA的种群测序法敏感性较低，当新形成的变异株数量较少或是 中止治疗后变异株降低时难以鉴别。其他的方法比如线性探针分析法，敏 感性虽然比普通PCR扩增病毒DNA的种群测序法增加5%-10%,但是变异株 的数量常常在它的检测最低水平以下。建立一种灵敏、特异、准确、快速、 方便的检测方法对于慢性乙型肝炎感染者抗病毒治疗中耐药性的确定和 监测具有重要意义。有研究者构建聚合酶链式反应-限制性片段长度多态 性(PCR-RFLP)与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针?并用这两种方法与直 接测序法检测拉米夫定药物治疗的乙肝患者血清HBV,实验结果显示， PCR-RFLP与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法可以检测野牛型YMDD和它 的变异型YTDD和YVDD,但Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法鉴定耗时少， 更敏感。Wang Q等用同样的方法检测15例单纯HBsAg ( + )样本，结果有 4例HBsAg( + )样本未能被普通TaqMan探针检测出阳性,而使用LNA-TaqMan 探针法检测全为阳性。Sun z等建立TaqMan-LNA探针多重实时PCR (multiplex realtime PCR)方法鉴别野生型和突变型菌株。研究发现这 种灵