磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达以及单抗的筛选和制备-生物医学专业毕业论文.docxVIP

华东师范人学硕fj论文 华东师范人学硕fj论文 摘要 论文摘要 原发性肝癌(HCC)是一种世界范围内的高发性癌症，是肝细胞或者肝内胆 管上皮细胞的恶性肿瘤，具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、易转移 的特点。是全球第三位、我国第二位的癌症死因，且发病率有逐年上升的趋势。 是严重威胁我国人民身体健康的恶性肿瘤，亟待针对肝癌新的渗断和治疗方面的 研究。 磷脂酰肌醇蛋白聚糖．3(GPC3)是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复 杂糖蛋白复合物，广泛表达于细胞表面，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细 胞膜表面，能和多种细胞外生长因子结合，在机体的发育中具有重要的作用。磷 脂酰肌醇蛋白聚糖．3与肝癌发生、发展有着密切的关系，并且在HCC中特异性 高表达，是检测原发性肝癌的重要血清学标志和治疗的候选靶标。制备GPC3的 高效特异抗体，对更好地探寻GPC3在肝癌发生，发展中的作用，建立灵敏准确 的诊断肝癌的方法，以及拓展对肝癌治疗的研究，有重要的意义。 本论文主要分为以下三个部分： 一、构建用于原核表达GPC3 C端序列的大肠杆菌工程菌并诱导表达 采用基因工程方法，构建GPC3 C端序列的表达载体，转入大肠杆菌工程菌 后，获得了表达GPC3 C端序列的工程菌株BL21．pET32．GPC3、 BL21-plGH3．GPC3。通过IPTG化学诱导表达，成功使得工程BL21一pET32．GPC3、 BL21．plGH3．GPC3表达融合蛋白Trx．GPC3和plGH3一GPC3，并通过肠激酶切， 成功获得GPC3蛋白的C端部分。 二、单克隆瘤细胞的制各 以纯化的GPC3 C端蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，取血清效价最高的小鼠 脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合；通过HAT选择性培养基筛选，获得杂交瘤 细胞，再经有限稀释法筛选，获得能大量分泌特异性抗GPC3抗体的杂交瘤细胞 株GPC3．9、GPC3．1l；将细胞株GPC3—9、GPC3．11接种至健康BALB／c小鼠腹 华东师范人学硕l：论文 华东师范人学硕l：论文 摘要 腔，大量制备腹水型单抗，并对其进行抗体亲和力测定，分别K=I．668×109mol／L 4-O．188，K=1．668x109mol／L 4-O．188；通过细胞ELISA，细胞蛋白Western Blot 证实，单克隆抗体GPC3．9、GPC3—11可以特异性结合肝癌细胞HepG2中的GPC3 蛋白。 三、利用噬菌体抗体库中筛选噬菌体单克隆抗体 利用原核表达的GPC3在人源噬菌体抗体库Tomilison I+J中筛选，得到抗 GPC3的四株噬菌体抗体。 本论文通过基因工程技术，构建了表达GPC3 C端序列的载体，在大肠卡l：菌 中诱导表达了重组GPC3 C端蛋白，并作为抗原筛选建立了分泌特异性结合 GPC3抗体的鼠单克隆瘤细胞系，同时在人源噬菌体抗体库中进行筛选。期望能 得到特异性抗GPC3的高亲和力抗体，以应用于诊断，治疗原发性肝癌的研究工 作。 关键词：原发性肝癌GPC3 单克隆抗体噬菌体抗体库技术 华东师范人学硕i：论文 华东师范人学硕i：论文 Abstract ABSTRCT Hepatocellular carcinoma(HCC)is a cancer with worldwide high incidence， oiginating in the liver cells or intrahepatic bile duct epithelial cells．Hepatocellular carcinoma is a maligancy which can hide for a long incubation period and transfer easily and rapidly．HCC is the third cause of cancer death in the world，and second in China；it’S a se