日本血吸虫过氧化物还原酶1基因克隆表达与-中国病原生物学杂志.DOCVIP

日本血吸虫中国大陆株过氧化物氧化还原酶1的表达及生物学功能 金一§，柯雪丹§， 余传信*，宋丽君，王玠，殷旭仁，沈双，陶永辉，张英， 许永良，杨静 [摘要］ 目的 制备重组日本血吸虫过氧化物氧化还原酶1（rSj Prx1）蛋白，并研究其生物学功能。方法 采用RT-PCR方法，从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出编码Sj Prx1蛋白的基因片段，将Sj Prx1基因亚克隆到表达载体pET28a(+)中构建重组表达质粒Sj Prx1-pET28a。将重组表达质粒Sj Prx1-pET28a转化到E. coli BL21中，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达rSj Prx1蛋白，通过镍柱亲和层析法从表达产物中纯化rSj Prx1蛋白。 采用生物化学方法分析rSj Prx1对底物H2O2进行还原的酶活性。用纯化的rSj Prx1蛋白免疫小鼠，酶联免疫法检测小鼠血清抗体水平的变化，观察其免疫原性。通过免疫印迹法观察rSj Prx1蛋白对血吸虫感染血清的免疫反应性。以纯化rSj Prx-1蛋白刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察受刺激后RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化，通过RT-PCR检测受刺激后RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶表达水平的变化，采用细胞因子检测试剂盒分析巨噬细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化，以观察rSj Prx1蛋白的免疫调节功能。 结果 通过RT-PCR获得编码Sj Prx1蛋白的基因片段，并成功构建了重组表达质粒Sj Prx1-pET28a。含重组质粒Sj Prx1-pET28a的转化子细菌在经IPTG诱导可表达出可溶性Sj Prx1蛋白。纯化的rSj Prx1具有氧化还原活性，可还原底物H2O2。rSj Prx1蛋白刺激小鼠免疫系统可产生高效价的抗体反应，能特异地被日本血吸虫感染病人、病兔及病鼠血清所识别，但不能被健康人、健康兔及鼠血清所识别，而免疫血清同样可能识别来源于血吸虫成虫及虫卵的天然Sj Prx1蛋白，显示rSj Prx1蛋白具有天然的高度特异的免疫原性。rSj Prx1可诱导巨噬细胞表达与M2型转化相关的高水平的IL-10,精氨酸及CD206。结论 rSj Prx1蛋白被成功制备，它具有天然的酶学特性和免疫原性和Th2型免疫调节功能，为进一步发展新的血吸虫病治疗药物，免疫调节方法奠定了 [关键词］ 日本血吸虫；过氧化物氧化还原酶-1；基因克隆；表达；纯化；酶学活性；免疫原性；免疫调节 [基金项目] 国家自然科学基金30972581)；江苏省自然科学基金 （BK2008110）；国家传染病重大专项（2012ZX10004-220） [作者单位] 江苏省血吸虫病防治研究所新技术研究室，卫生部寄生虫病预防与控制重点实验室 [作者简介] 金一(联系电话邮箱:duodu163.com)，女，硕士研究生。研究方向：长效药物 §共同第一作者 *通信作者 E-mail： chxnyu@163.com(联系电话 Expression and biological function of peroxiredoxin-1 of Schistosoma japonicum (Chinese strain) Jin Yi§, Ke Xue-dan§, Yu Chuan-xin*, Song Li-jun, Wang Jie, Yin Xu-ren, Shen Shuang, Xu Yong-liang, Yang Jing Department of Novel Biotechnology for Parasitic Diseases Prevention and Control, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases; Key Laboratory on Technology for Parasitic Disease Prevention and Control, Ministry of Health, Wuxi 214064, China § Authors with the same contribution * Corresponding author ［Abstract］Objective To prepare and \t investigate the biological function of the recombinant peroxiredoxin-1 of S. japonica (rSj Prx1). Methods The DNA fragment